不同杀菌条件下苹果醋风味、营养及活性成分的变化

马艳蕊，于 红，初 乐，赵 岩，朱风涛，和法涛，范 琳，刘光鹏*

（1.中华全国供销合作总社 济南果品研究院，山东 济南 250200；2.威海职业学院 康养学院，山东 威海 264210）

苹果具有丰富的营养成分，富含粗纤维素、多糖、维生素、多酚、人体必需的微量元素等[1-5]，是日常生活中最受人们喜爱的水果之一。随着苹果种类的不断丰富，种植面积的不断扩大，我国苹果产量也日渐攀升，2020年全国苹果产量达4 100万t，随之出现的苹果精深加工产业日渐完善，在满足人们多样化食用需求的同时，也逐步实现了苹果产业的可持续发展[6]。

苹果醋是以鲜苹果或苹果汁为原料，经酒精发酵和醋酸发酵后得到的一种健康饮品，不仅风味优良，而且兼有水果和食醋的营养和保健效用[7-8]。苹果醋中富含有机酸、维生素、氨基酸、果胶、矿物质等成分[9-11]，具有改善血液循环、抵抗病菌侵害、对抗关节炎、延缓衰老、促进消化、美容护肤、防止血压升高和动脉硬化、排除毒素、调节钙质代谢等多种保健功效[12-14]。随着人们对食品要求的不断提高，苹果醋产品日渐受到消费者的青睐。

苹果醋中的挥发性香气物质、营养及活性成分含量是决定苹果醋风味的关键，也是决定苹果醋品质的重要因素[15]，在以往的研究中，人们多关注于发酵工艺对苹果醋风味的影响，而杀菌作为苹果醋生产中的必要环节，其对苹果醋风味的影响研究鲜有报道。邓娜娜[16]研究了加热、超声波、微波三种杀菌方式对桑葚醋风味的影响，结果表明微波杀菌后的桑葚醋香气品质最好，但由于微波杀菌成本较高，不适于在果醋加工产业中广泛应用。热力杀菌是苹果醋生产过程中最常用的杀菌方式，主要的热力杀菌方式有：低温长时（low temperature long time，LTLT）杀菌、高温短时（high temperature short time，HTST）杀菌及超高温瞬时（ultra high temperature short time，UHTS）杀菌等。LTLT杀菌法也称为巴氏杀菌，处理温度通常在100 ℃以下，典型的巴氏杀菌的条件是62.8 ℃、30 min，LTLT杀菌简单、方便，杀菌效果达99%，致病菌完全被杀死，但不能杀死嗜热、耐热性细菌、孢子，以及一些残存的酶类。HTST杀菌是指100 ℃以上，130 ℃以下的杀菌处理，其加热时间短，营养成分损失少，处理量大，适于连续化生产，节省热源，成本低。UHTS杀菌是指130～150 ℃持续时间几秒的处理，UHTS杀菌温度高，杀菌时间极短，杀菌效果显著，引起的化学变化少，但设备成本较高。不同的加热方式、加热温度、加热时间都会对苹果醋的挥发性香气成分、营养及活性成分含量产生很大影响。本研究拟采用HTST杀菌方式对苹果醋原液进行杀菌处理，并探究不同杀菌温度和杀菌时间下苹果醋中风味、营养及活性成分的变化，深入了解HTST杀菌对苹果醋品质影响，为苹果醋的杀菌技术提供科学依据，对苹果醋生产中稳定品质具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料和菌株

新鲜苹果：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BV818：安琪酵母股份有限公司；弱氧化醋酸杆菌（Acetobacter suboxydans）（沪酿1.01）：本实验室保藏。

1.1.2 化学试剂

葡萄糖（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；碳酸钙、氢氧化钠、硝酸铝（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；酵母膏（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸二氢钾（分析纯）：天津市广成化学试剂有限公司；琼脂（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.3 培养基

醋酸菌液体培养基：葡萄糖1%，酵母膏1.5%，磷酸二氢钾0.05%，无水硫酸镁0.05%，pH自然，121 ℃灭菌20 min后冷却至室温，加入体积分数为3%的乙醇。

醋酸菌固体培养基：葡萄糖2%，酵母膏1%，碳酸钙2%，琼脂2%，pH自然，121 ℃灭菌20 min后冷却至50 ℃左右，加入体积分数为3%的乙醇。

1.2 仪器与设备

YXQ-LX-100A高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；ST-20高温杀菌设备：上海顺仪实验设备有限公司；SWCJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；RS-232恒温振荡培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；BIOF-6010B/S/B/Z微生物发酵罐：上海高机生物工程有限公司；6890N-5973N气质联用（gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）仪：美国安捷伦（中国）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌的活化

在无菌条件下，从菌种保藏斜面中挑取一环醋酸菌菌种，以划线方式在醋酸菌固体培养基上进行活化，置于30 ℃恒温培养2 d。从固体平板上挑取活化后的菌种接入50 mL醋酸菌液体培养基中，置于30 ℃、180 r/min摇床中振荡培养过夜，制成一级种子液。取15 mL一级种子液接入300 mL灭菌后的苹果汁中，置于30 ℃、180 r/min摇床中振荡培养过夜，制成二级种子液。

1.3.2 苹果醋的制备

将鲜苹果破碎压榨过滤取汁，加热至90 ℃杀菌后灌入发酵罐中，按0.2‰接种量接入活性干酵母，30 ℃条件下静置发酵5～7 d，直至残糖降至0.4%以下，得到苹果酒。将苹果酒用硅藻土进行过滤，尽量去除酵泥，按10%的接种量接入上步制得的醋酸菌二级种子液，设定发酵罐温度为30 ℃，搅拌转速为1 200 r/min，通风速率为2 L/min发酵3～4 d，直至发酵液的酸度不再上升，设置不同条件进行杀菌处理，得到苹果醋。

1.3.3 杀菌条件的设计

如表1所示，设定五种不同杀菌条件，五种杀菌条件处理后的苹果原醋均能达到商业无菌要求，其中样品S1为未经过杀菌处理的对照组。

表1 苹果醋样品杀菌条件的设计Table 1 Design of sterilization conditions for apple vinegar samples

1.3.4 分析检测

（1）挥发性香气成分的测定

苹果醋中挥发性香气成分测定采用GC-MS法。准确称取5.00 g果醋置于20 mL样品瓶中，加入10 μL质量浓度为32.88 μg/mL的2-辛醇内标，加盖密封，待测。

GC分析条件：DB-5MS色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气（He）（纯度99.999%）；流速1.660 mL/min，不分流；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升温至200 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升温至250 ℃，保持8 min。

MS条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度为280 ℃，四级杆温度为150 ℃，传输线温度为280 ℃，扫描范围为50～600 m/z。

（2）总酚测定

采用福林-肖卡法（Folin-Ciocalteu）对苹果醋中总酚含量进行测定[17]。

（3）总黄酮测定

参考范祺等[18]的硝酸铝显色法对苹果醋中总黄酮含量进行测定，略有改动。准确称取芦丁标准品0.010 0 g，用体积分数为50%的乙醇溶解并定容至100 mL，制备成质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。用移液枪分别吸取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL的芦丁标准液置于试管中，用体积分数为50%的乙醇稀释补充至2.5 mL，漩涡混匀后加入5%的NaNO2溶液0.15 mL，摇匀后静置6 min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.15 mL，漩涡混匀，室温放置6 min，随后加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，摇匀，在波长510 nm处测定吸光度值，得到以芦丁标准液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标的标准曲线，标准曲线方程式为：y=0.005 5x-0.003 6（R2=0.999 5），按照标准曲线回归方程计算样品中总黄酮的含量。

（4）抗坏血酸测定

参考国标GB 5009.86—2016《食品中抗坏血酸的测定》中的2,6-二氯靛酚滴定法。

（5）有机酸测定

参考国标GB 5009.157—2016《食品中有机酸的测定》。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌条件下苹果醋中营养及活性成分含量的变化

经过检测分析，六种样品中的营养及活性成分含量测定结果见图1。由图1A可知，与对照样S1相比，杀菌后样品的总酸含量变化并不显著（P＞0.05）；由图1B可知，与对照样S1相比，样品S2和S3总酚含量变化不显著（P＞0.05），而样品S4、S5及S6总酚含量显著降低（P＜0.05）；由图1C可知，与对照样S1相比，样品S2、S3及S4抗坏血酸含量变化不显著（P＞0.05），样品S5抗坏血酸含量显著降低（P＜0.05），样品S6抗坏血酸含量极显著降低（P＜0.01）；由图1D可知，与对照样S1相比，样品S2和S4总黄酮含量变化不显著（P＞0.05），而样品S3、S5及S6总黄酮含量显著降低（P＜0.05），说明随着温度的升高，会对酚类物质、抗坏血酸和黄酮产生破坏，致使含量下降[19]。由图1E可知，与对照样S1相比，除样品S5苹果酸含量显著增加（P＜0.05），其余样品苹果酸含量变化不显著（P＞0.05）。与对照样S1相比，所有样品柠檬酸含量均有极显著增加（P＜0.01），可能是由于高温使得柠檬酸盐分解。

图1 不同杀菌条件下苹果醋中营养及活性成分含量的变化Fig.1 Changes of nutrition and active ingredients contents in apple vinegar under different sterilization conditions

总体来说，过高的杀菌温度会对苹果醋中的营养及活性成分含量产生较大影响，较低的杀菌温度对苹果醋中有机物含量的变化影响较小，结合图1中数据，100 ℃、30 s条件下杀菌对苹果醋中的营养及活性成分含量影响较小，为较佳杀菌条件。

2.2 不同杀菌条件下苹果醋中挥发性香气成分的变化

经过GC-MS 检测，不同杀菌条件下6种样品中的挥发性香气成分含量测定结果见表2。由表2可知，在不同杀菌条件下的6种苹果醋样品中共检测到50种挥发性香气成分，其中有35种共有物质。未经杀菌处理的苹果醋样品S1中共检测到38种挥发性香气成分，其中酯类15种，占比65.48%；酸类5种，占比9.96%；醇类8种，占比12.54%；醛类2种，占比0.88%；烃类2种，占比0.19%；酮类1种，占比0.17%；其他类5种，占比10.78%。样品S2中共检测到40种挥发性香气成分，其中酯类16种，占比61.53%，酸类5种，占比10.00%，醇类7种，占比13.83%，醛类2种，占比1.03%，烃类4种，占比1.75%，酮类1种，占比0.19%，其他类5种，占比10.79%。样品S3中共检测到41种挥发性香气成分，其中酯类15种，占比62.22%，酸类5种，占比9.93%，醇类8种，占比13.12%，醛类2种，占比1.58%，烃类2种，占比0.18%，酮类2种，占比0.49%，其他类7种，占比12.27%；样品S4中共检测到39种挥发性香气成分，其中酯类15种，占比61.32%，酸类5种，占比9.83%，醇类7种，占比13.10%，醛类2种，占比1.87%，烃类1种，占比0.09%，酮类2种，占比0.31%，其他类7种，占比12.48%；样品S5中检测到42种挥发性香气成分，其中酯类15种，占比57.91%，酸类5种，占比13.39%，醇类9种，占比13.74%，醛类2种，占比1.97%，烃类3种，占比0.41%，酮类2种，占比0.30%，其他类6种，占比13.48%；样品S6中共检测到46种挥发性香气成分，其中酯类17种，占比56.94%，酸类5种，占比12.69%，醇类11种，占比16.68%，醛类2种，占比2.01%，烃类3种，占比0.43%，酮类2种，占比0.29%，其他类6种，占比10.97%。由此可见，酯、醇、酸类物质是苹果醋中主要的挥发性香气成分，其中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正戊醇、苯乙醇、乙酸、仲丁基醚是对苹果醋风味贡献较大的特征香气成分。

表2 不同杀菌条件下苹果醋中挥发性香气成分含量检测结果Table 2 Determination results of volatile aroma components in apple cider vinegar under different sterilization conditions mg/L

续表

续表

2.2.1 酸、醇、酯类物质变化

有机酸是苹果醋中主要的呈酸物质，包括苹果酸、乙酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸等，乙酸是主要挥发性酸[20]，主要是由醋酸杆菌利用乙醇产生的[16]。在本实验的六个样品中均有乙酸检出，但含量比较少，可能是在发酵过程中乙酸转化生成了其他的香气成分[21]。经过杀菌处理后大部分样品中的酸类物质有不同程度的上升，总体呈随杀菌温度升高而提高的趋势，其中，醋样S2和S3和醋样S1中的酸类物质含量接近。分析其原因可能是在高温条件下酯类物质分解，导致酸类物质含量升高。

与对照醋样相比，经过不同杀菌条件处理后的苹果醋样品的醇类物质总含量均有所上升，其中正戊醇和苯乙醇含量上升明显，这可能是由于杀菌过程中的热能使一些结合醇中的糖苷健断裂[22]，或是氨基酸的去氨基及去碳酸基反应使样品中的醇类物质含量升高[23]。

酯类物质是苹果醋中检测到含量最多的一种化合物，常具有花香或果香，乙酸乙酯是其中含量最高的一种酯，除醋样S2外，其他杀菌条件下的醋样中乙酸乙酯含量均有所提升，这与样品中乙酸含量的高低有直接联系。而只有醋样S2中产生了具有青香、药草香、浆果香的己酸己酯，只有醋样S6中产生了苯乙酸乙酯。总体来说，经过杀菌处理后的苹果醋样品中的酯类物质总含量与对照相比均有所下降，原因可能是加热处理让酯类物质产生了分解反应，同时生成了部分醇类和酸类物质[24]。

2.2.2 酮、醛、烃类物质变化

酮类物质一般呈脂肪味和焦燃味，随着碳链的增长呈现出强的花香特征，苹果醋经过杀菌后酮类物质含量均有所提升，除醋样S2外，其他杀菌条件下处理的苹果醋样品中均检测到3,4-二甲基-2-戊酮，具有强烈玫瑰花香气的大马士酮的含量也随着杀菌温度的升高而提升，可能是由于高温产生的热效应，增强了分子的活化能，促进了氧化反应。

与对照相比，杀菌后样品中的醛类物质含量有明显的升高。苯甲醛具有苦杏仁味，会给苹果醋香气带来不利影响，其含量呈随温度升高而升高的趋势，可能是由于加热处理后有效激活了糖苷酶的活性，从而水解糖苷类物质，使以糖苷类结合的苯甲醛游离[21]，因此苹果醋的杀菌温度不宜设定过高。

不同的杀菌条件对苹果醋中烃类物质的含量影响较大，其中只有在醋样S2中检测到α-法尼烯的产生，其具有强烈的花香气味。

在本实验各样品中，酯类物质的含量高、种类多；酸类与醇类也是苹果醋中的主要挥发性香气成分，醛类、烃类和酮类的含量较少，这一结论与前人的研究结果一致[25-26]。随着杀菌温度的升高，酯类物质在挥发性香气成分中的占比总体呈下降趋势，醋样S1和S2中酯类物质含量相对较高，且其他种类物质含量与对照样相比变化较小，为较适宜的杀菌条件。

3 结论

不同的杀菌条件会对苹果醋中营养、活性成分和挥发性香气成分的变化产生较大影响。总体来说，较低的杀菌温度对苹果醋中总酸、总酚、黄酮、抗坏血酸、苹果酸的含量影响不大，挥发性香气成分含量小有浮动，随着杀菌温度的升高，酯类物质的含量明显下降，而酸类、醇类和醛类物质的含量呈上升趋势，因此杀菌温度不宜过高，以免破坏苹果醋的风味体系。结合对不同杀菌条件下苹果醋中营养、活性成分和挥发性香气成分的分析，得出100 ℃，30 s杀菌条件下苹果醋中的营养、活性成分及挥发性香气成分含量相对其他杀菌条件变化较小，为较佳杀菌条件。

苹果醋的感官特征是由各种不同的有机物质和挥发性香气成分协调作用所产生的，六种苹果醋样品检测出50种风味成分，而共有的风味成分仅35种，这说明不同的杀菌条件下苹果醋中的风味成分含量会产生较大变化，进而影响苹果醋的品质。因而，杀菌条件对苹果醋的影响及其香气特征需要进一步的研究，以便为苹果醋品质的提升及感官评价体系的建立提供更加科学的参考依据。