MicroRNA－218单核苷酸多态性与结直肠癌易感性的关系*

李天煜，庞彩莲，徐瑞梅，林悠阅，吕昕琪，范志豪，钟展华，何俊力，袁朝汉，魏驰誉，黄舒琪，谢烷颐，廖日煜

广东医科大学 1外科学教研室，3公共卫生学院，4研究生学院（广东东莞523808）；2东莞市大朗医院检验科（广东东莞523770）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是发生于结直肠上皮的恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤中的第3位，同时也是癌症致死的第二大原因［1］。到2030年，预计CRC的全球疾病负担将增加60%，新增病例将超过220万，死亡人数将超过110万［2］。结直肠癌的发生、发展是一个多要素的病理变化过程，且涉及多个基因的改变。遗传因素在CRC发病中起重要的作用［3］。然而，CRC的发病机制尚不完全清楚，有待进一步研究。MicroRNAs（miRNAs）是一种参与肿瘤发生、发展的调节性非编码RNA，它通过与蛋白质编码mRNAs的3′端非编码区（3′－UTR）结合，导致靶mRNA分子的翻译抑制，在基因编码转录后调控中发挥重要作用。单个miRNA可调控多个靶mRNAs，miRNA可调控约60%的人类基因［4］。目前研究显示miR－218 rs11134527、miR－25 rs41274221、miR－143 rs4705342、miR－106a rs137881717的基因多态性与不同类型癌症的发生、发展相关［5］。而microRNA－218 rs11134527的GG基因型与多种癌症的发生、发展存在密切相关性，尤其与消化道肿瘤有潜在关联。我们初步筛选实验表明microRNA－218 rs11134527可能与CRC有潜在关系，并影响CRC的发生、发展。在此基础上，应用聚合酶链式反应－连接酶检测反应技术（LDR－PCR）检测上述基因在CRC患者血清中的表达水平，并采用二元逻辑回归分析对miR－218 rs11134527等4个多态位点与CRC易感性的关联程度进行评估，旨在探讨其多态位点在CRC诊断中的临床价值，为CRC的筛查、诊断、治疗及预后提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广东医科大学附属医院、江门市中心医院、东莞市人民医院和东莞市大朗医院2017年8月至2019年7月确诊为CRC并未作任何治疗的66例患者（CRC组）。此外，选择124例来自同期4个医院且体检结果均为正常的健康个体作为对照组。所有CRC患者和正常健康个体均为无血缘关系的人群。所有CRC患者均经过组织病理学证实。本研究收集CRC患者标本时，采集患者静脉血标本2 mL，经EDTA－K2抗凝，－20℃保存，进行后续实验。本研究经严格审查批准，获得相关4个医院医学伦理委员会的批准进行人体组织细胞采集、检查与实验，并与患者签署知情同意书。

1.2 基因组DNA的提取、分型 在受试者知情同意后，提取每个样本的外周静脉血，加入抗凝剂后充分混匀。用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取各样品的基因组DNA，并将提取的DNA保存在－80℃冰箱中，直至下一步的基因分型。对66例结直肠癌患者和124例健康对照者的microRNA－218 rs11134527、microRNA－25 rs41274221、microRNA －143 rs4705342 和 microRNA －106a rs137881717多态位点采用聚合酶链式反应－连接酶检测反应技术（LDR－PCR）进行分型。MicroRNA－218 rs11134527、microRNA－25 rs41274221、microRNA－143 rs4705342 和 microRNA－106a rs137881717四个单核苷酸多态性的基本信息在国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）提取，见表1。首先构建PCR反应体系，总体积为20μL，包括50 ng基因组DNA样品、1×PCR缓冲液、3 mmol／LMg2＋、2 mmol／L／每个dNTP、0.5 p引物混合物和1 U Taq DNA聚合酶。引物序列见表2。第二步是建立一个LDR反应体系，该反应体系总体积为10μL，其中包含1μL LDR缓冲液、第一步的4μL PCR产物、每种探针混合物2 pmol和2 U Taq DNA连接酶。探针序列见表3。在基因分型过程中，随机选择15%的样品进行重复测定，与先前测定结果一致率为100%。

表1 rs11134527、rs41274221、rs4705342、rs137881717的基本信息

表2 引物的信息

表3 探针的信息

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和统计分析，使用SHEsis软件（http：／／analysis.bio－x.cn／myAnalysis.php）对microRNAs进行单倍体估算和分析。对照组采用χ2检验4个microRNA多态位点的基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡原则。最后，通过二元逻辑回归分析评估microRNA－218 rs11134527和其他4个单核苷酸多态性与CRC易感性的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MicroRNA－218 rs11134527及其他3个单核苷酸多态性的基本信息 与NCBI数据库中国受试者的最小等位基因频率（MAF）对比，本研究对照组中4个单核苷酸多态性的MAF极为相似。结果显示，对照组中除了rs41274221外，Hardy－Weinberg平衡测试均正常（P＞0.05），见表4。因此，本研究样本群体的基因型频率分布大多遵循Hardy－Weinberg平衡原则。

2.2 MicroRNA－218 rs11134527及其他3个单核苷酸多态性与CRC易感性的关联分析 基因型关联分析中，CRC组和对照组仅有microRNA－218 rs11134527这一单核苷酸多态性有显著差异。二元逻辑回归分析显示，与AG、AA基因型相比，microRNA－218 rs11134527中GG基因型与CRC易感性增加相关（OR＝2.31，95%CI：1.04～5.15，P＝0.04），表明携带有GG基因型个体的CRC发病风险比携带AG或AA基因型个体高出2.31倍。在等位基因和基因型分析中并未发现其余3个单核苷酸多态性与CRC易感性有任何关联（P＞0.05）。见表4。

表4 MicroRNA－218 rs11134527等4个单核苷酸多态性与CRC易感性的关联分析 数量（%）

2.3 MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342两个单核苷酸多态位点形成的单体型与CRC易感性的关联分析 通过进一步的结构分析，MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342均位于5号染色体上，这2个单核苷酸多态位点位于同一个单体型区。同时，单倍体连锁不平衡测试提示microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342之间存在连锁关系。因此，本研究进一步对比CRC组和对照组之间两个单核苷酸多态位点形成的单体型频率。纳入本研究的2个单核苷酸多态位点的4种常见单体型（频率＞3%）几乎占单体型变异的100%。单体型分析结果显示，microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342形成的4种常见的单体型均与CRC易感性不存在任何关联（P＞0.05）。见表5。

表5 MicroRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342两个单核苷酸多态位点形成的单体型与CRC易感性的关联分析数量（%）

3 讨论

CRC是一种多步骤、多因素、多基因疾病，由多种环境、生活方式和个体的遗传易感因素共同作用的结果，其中个体遗传易感性是CRC发生、发展的主要动因。miRNAs在肿瘤发展过程中特异度较高，稳定性好，因此microRNA对癌症生物学具有重要意义，已有研究证实miRNAs可以作为乳腺癌、肺癌、肾癌等［6－8］肿瘤的生物标志物。越来越多的研究表明，microRNA表达失调在CRC的发展和转移中发挥着功能性的作用［9］。

MicroRNA－218 rs11134527已被有关研究证实与肺癌［10］、宫颈癌［11］、食管鳞状细胞癌［12］等多种癌症的发生、发展密切关联。然而，这些研究均提供了不同的结果。2018年Danesh等［13］报道microRNA－218 rs11134527单核苷酸多态性增加了患乳腺癌的风险。此外，Chuanyin等［11］发现，microRNA－218 rs11134527的GG基因型在宫颈上皮内瘤样变组和对照组中比AA和AG基因型具有更高的宫颈癌风险。在此基础上，我们进行了基因型关联分析研究，结果表明microRNA－218 rs11134527与CRC的易感性增加有关（OR＝2.31，95%CI：1.04～5.15），CRC组和对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。而microRNA－25 rs41274221、microRNA－143 rs4705342和microRNA－106a rs137881717与CRC易感性却无关联（P＞0.05）。再进一步分析位于5号染色体同一个单体型块上2个单核苷酸多态位点microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342，结果示2个单核苷酸多态位点形成的单体型与CRC易感性不存在关联。

目前，已有研究发现microRNA－218 rs11134527的AG ＋GG基因型与非小细胞肺癌的易感性降低有关［10］；而本研究表明，与AG和AA基因型相比，携带有GG基因型个体的CRC发病风险比携带AG或AA基因型个体高出2.31倍。He等［14］报道microRNA－218 rs11134527的A＞G单核苷酸多态性可降低个体罹患神经母细胞瘤的风险，这提示G等位基因可能是多种疾病发展的保护因子，但其在CRC中的作用有待进一步研究。

近年来有许多microRNA被报道可用于癌症的化学治疗，对降低肿瘤细胞的抵抗性有一定的作用。Nangia－Makker等［15］发现上调microRNA－145的表达和阻断Wnt／β－catenin的信号可抑制CRC耐药干细胞的增殖和克隆。目前CRC的主要化疗方案是奥沙利铂／氟尿嘧啶方案，血清中microRNA－92a－3p的高表达也与CRC的转移和化疗耐药性高度相关［16］。microRNA－218可通过靶向Rictor增加宫颈癌患者对化疗药物雷帕霉素的敏感性［17］。通过靶向Glut1，microRNA－218也增加了膀胱癌对化疗药物顺铂的敏感性［18］。miR－218可通过下调TS的表达，与5－氟尿嘧啶共同抑制CRC细胞的发生、发展，microRNA－218还可通过靶向BIRC5增强5－氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡，从而增强药物疗效［19］。除BIRC5外，胸苷酸合酶（TS）也被发现与5－氟尿嘧啶的耐药有关。奥沙利铂作为化疗的基础药物之一，其临床发展也受到CRC细胞耐药性的限制。Fu等［20］发现miR－218的高表达可以抑制CRC细胞的自噬，显著提高肿瘤对奥沙利铂的敏感性。此外，一些研究证实miR－218联合MALAT1（一种长链非编码RNA）应用可以抑制上皮细胞－间充质转化（EMT）过程，从而影响癌细胞对奥沙利铂的敏感性［21］。以上结果表明，microRNA－218有望成为降低CRC细胞耐药性的关键靶点，但需要进一步的研究来证明。

综上所述，本研究通过分析microRNA－218 rs11134527证明了microRNA－218 rs11134527与CRC易感性之间的关联。然而，microRNA－218 rs11134527和microRNA－143 rs4705342单核苷酸多态性位点形成的单倍型与CRC的易感性无关。本研究的结果拓展了CRC易感基因的数据库，并为未来的研究人员提供了研究方向。此外，microRNA－218 rs11134527有望成为未来CRC发生、发展的重要预测指标，为CRC的早期诊断和治疗奠定坚实的分子基础。

（志谢：感谢广东医科大学附属医院、东莞市人民医院、东莞市大朗医院、江门市中心医院胃肠外科的医护人员，在实验中尤其是标本收集提供便利。）