DNA甲基化与鱼类年龄

张云丽， 周传江＊

（河南师范大学水产学院； 河南省水产动物养殖工程技术研究中心；水产动物疾病控制河南省工程实验室， 河南新乡 453007）

鱼类年龄是研究鱼类生物学和种群生态学的基础，准确的年龄鉴定对于鱼类的生长、繁殖和死亡具有重要意义， 可以更好地为渔业资源保护和开发利用提供理论支持。 传统的鱼类年龄鉴定方法有一定局限性，无法在不致命情况下精准确定鱼类年龄。多年来，表观遗传学研究发现，DNA甲基化与衰老之间存在着密切相关性， 为探索更佳的鱼类年龄鉴定方法提供了新思路。

1 鱼类年龄鉴定

1.1 鱼类年龄鉴定意义

年龄是生态学中最重要的因素之一， 因为它既影响个体特征，也影响种群特征。各种生物学特性随着年龄的增长而变化， 包括那些影响动物生物学状态的特性，例如生殖特性、行为等。 而且因为动物种群内的年龄分布会显著影响种群的维持， 所以动物年龄也是影响动物种群特征的一个重要因素。

在渔业种群评估和鱼类生态学方面， 年龄是最重要的生物变量之一。 鱼类的年龄被用来计算重要的生活史特征，如生长参数、自然死亡率等。 年龄和大小是评估鱼类种群结构的最具信息性的指标。 然而，收集年龄数据对许多鱼类来说是昂贵且有限的，对部分鱼类而言， 则无法收集到直接的年龄数据。

1.2 鱼类年龄鉴定方法

传统的鱼类年龄鉴定方法主要为自然长度分布曲线法、硬组织鉴定法、放射性碳定年法，这些方法各有优点，但又有一定局限性，因此，探寻鱼类年龄鉴定的替代方法是非常必要的。

1.2.1 自然长度分布曲线法

自然长度分布曲线法是较早使用的方法， 即通过大量渔获物体长频率数据构成长度频数曲线模型，通过曲线的峰值分析年龄，但是难以捕捞到所有年龄组个体，所以只能获得种群年龄结构，无法准确鉴定个体年龄， 而且在鱼类生长发育的过程中，水温、饵料等都会影响鱼类个体大小，因此该方法最好结合其他鱼类年龄鉴定方法，作为其佐证。

1.2.2 硬组织鉴定法

鉴定鱼类年龄的主流方法是硬组织鉴定法，鱼类硬组织包括钙化组织（鳞片、耳石、脊椎骨、鳍条、鳃盖骨、匙骨等）和晶状体。 鱼类的鳞片是体表衍生的具有保护作用的硬薄片状结构， 其年龄标志主要是基于鳞片环纹的生长和排列： 通常在营养物质丰富的春夏季节，鱼类生长迅速，鳞片上的同心环纹排列疏松， 形成疏带， 而在营养物质较匮乏的秋冬季节，鱼类生长速度减缓或停滞，鳞片上的同心环纹排列紧密，形成密带，一个疏带和一个密带构成一个年轮，二者间的交界处即为年龄标志。 因此可以通过读取鳞片上环纹数量对鱼类年龄进行鉴定， 在用于鉴定鱼类年龄的硬组织中， 鳞片数量最多， 取材最简便，但鱼体生长过程中对鳞片有重吸收现象，且鳞片会受到磨损，会产生副轮、幼轮、生殖轮等，不易辨认， 而且高龄鱼鱼体鳞片处于负生长甚至停止生长状态，会影响年龄鉴定。

鱼类的耳石是一种钙化组织， 存在于鱼类的内耳中，随着鱼类年龄增长而不断生长。其轮纹稳定持久，可用于鱼类年龄鉴定，且精确度较高，但耳石年轮鉴定的方法昂贵耗时且需要专业人员。 鱼类年龄和耳石质量之间也存在正相关关系[1]，耳石重量检测的方法简便快速且成本低， 但耳石重量会受到环境因素影响，会影响高龄鱼年龄鉴定精确度。

其他钙化组织（脊椎骨、鳍条、鳃盖骨、匙骨等）可通过读取生长轮纹作为其他年龄鉴定方法的佐证，在鳞片和耳石无法准确鉴定年龄时，可起替代作用。

鱼类眼睛晶状体呈圆球体， 是一种高度特化的组织， 由于脊椎动物晶状体核的晶体蛋白具有代谢惰性[2]，因此可以通过测量其直径与质量进行鱼类年龄鉴定，但高龄鱼会出现晶状体直径相同现象，影响高龄鱼年龄鉴定精确度。

1.2.3 放射性碳定年法

放射性碳定年法是利用自然存在的碳14同位素的放射性进行年龄鉴定， 目前所用生物材料主要是耳石和晶状体，在海洋渔业生态研究中，基于鱼类耳石的放射性碳定年法的应用越来越广泛。 该方法操作简单，鉴定结果精确度高，但需要大型仪器设备，分析成本昂贵。

2 DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一， 其变化受到内在因素和外在环境以及随机事件的影响。DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式， 它能够在不改变DNA序列的前提下， 对DNA序列中的碱基进行甲基基团修饰，以此抑制或促进基因的表达，与衰老、癌症及多种疾病的发生密切相关，是表观遗传学的热点研究内容。

2.1 DNA甲基化形成机理

所谓DNA甲基化是指甲基(CH3)在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下与胞嘧啶核苷酸相连，这些酶将甲基(CH3) 基团共价转移到DNA胞嘧啶环的C-5位置，形成5甲基胞嘧啶(5mC)的化学修饰作用，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是主要的底物，它为胞嘧啶生成5甲基胞嘧啶(5mC)提供实际的甲基(CH3)基团。 将甲基(CH3)基团传递给胞嘧啶后，最终形成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，是DNA甲基转移酶DNMTs的抑制剂。DNA甲基化反应分为从头甲基化和保留甲基化两种类型。 从头甲基化（denovo methylation）是2条链均未甲基化的DNA被甲基化； 保留甲基化（maintenance methylation） 是双链DNA的其中一条链已存在甲基化，另一条未甲基化的链被甲基化。

当一个鸟嘌呤(G)核苷酸与胞嘧啶(C)在DNA序列中被一个磷酸基(p)分开时，该区域被称为CpG位点， 脊椎动物中约有半数的基因在启动子上存在富含CpG的序列，即CpG岛。在DNA甲基化过程中，甲基(CH3)会在CpG位点被附着在DNA上的DNA甲基转移酶(DNMTs)催化。

2.2 DNA甲基化生物学意义

启动子CpG岛上胞嘧啶的甲基化可通过与转录因子结合或改变染色质结构等， 起到抑制基因转录的作用，且有研究表明，DNA甲基化可抑制印记基因的表达以及引起X染色体失活[3]。

多数基因本体缺乏CpG岛, 但其甲基化普遍存在。 通过对拟南芥、人类、水稻和斑马鱼等多个物种的全基因组DNA甲基化分析[4-6]，发现基因本体的DNA甲基化与基因转录水平有关。

增强子、 沉默子和转座子作为基因组中的作用元件，他们的甲基化变化会影响整个基因组。 其中增强子的DNA甲基化状态与基因活性之间呈反比关系，沉默子与之相反，而转座子在DNA甲基化程度高的情况下会抑制其转座活性， 从而维持基因组的稳定性。

3 DNA甲基化应用于年龄预测研究进展

越来越多的证据表明， 衰老的许多表现都是表观遗传的，衰老与DNA甲基化的变化有关，这是主要的表观遗传机制之一。 一般来说，DNA甲基化的年龄依赖性变化可以概括为基因组整体的低甲基化。 这被认为是由于维持DNA甲基转移酶1 (DNMT1)的酶活性[7]，同时伴有与基因表达变化无关的特定CpG位点的高甲基化所造成的结果。 除了这种“表观遗传漂变”之外，还有其他DNMT3b等DNA甲基转移酶（DNMTs）调控的DNA甲基化变化。在这种情况下，DNA甲基化变化遵循一定速度， 影响特定位点甲基化增加或减少，并可能导致功能后果。

衰老和DNA甲基化的关系很多年前就有人进行研究，在鱼类中，年龄和DNA甲基化之间的第一个联系是Berdyshev 等在1967 年发现的驼背大麻哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha) 中甲基化水平随着年龄的增长而减少[8]；Vanyushin等在1973年指出大鼠脑和心脏中的胞嘧啶甲基化修饰随着年龄的增加而减少[9]；Wilson等在1987年指出各年龄段人支气管上皮细胞的基因组甲基化水平也随着年龄的增加而减少，基因组5mdCyd（5-methyldeoxycytidine）水平也发生年龄依懒性降低，且DNA 5mdCyd的丢失率似乎也与潜在的最大寿命成反比[10]；Bocklandt等在2011年利用34对同卵双胞胎男性的唾液样本， 筛选出了88个与年龄相关的甲基化位点，并构建了首个DNAm年龄预测模型，但该模型准确度较低[11]；Heyn等在2012年利用CpG-poor启动子区域的甲基化程度的差异， 将新生儿和百岁老人的生物检材区分开[7]；Horvath在2013年提出了能体现人类衰老的“表观遗传时钟（Epigenetic clock）”概念，并开发了353个年龄相关的CpG位点组成的多组织年龄推断模型， 从而为使用DNA甲基化进行年龄预测奠定了基础[12]，该模型准确性高且适用于广泛的组织和细胞类型， 是目前应用最广泛、最经典的DNAm年龄推断模型，目前已被应用于癌症、衰老、阿尔兹海默病及生活方式与衰老的关联研究；Levine等在2018年利用9926名美国成年人的全血作为样本，通过Cox 惩罚回归和弹性网络回归，开发了新的衰老表观遗传生物标记物DNAm PhenoAge，可以更准确地预测全因死亡率、癌症、身体功能、行为生活方式等与衰老相关的各方面[13]；Xu等在2020年利用1280个非血液组织（包括骨髓、精子、唾液等17种）作为样本，通过主成分分析、聚类分析、梯度增强回归（GBR）算法，开发了可研究人类非血液组织DNAm与年龄关联的DNA甲基化年龄推断模型[14]。

4 DNA甲基化应用于鱼类年龄预测存在的问题及前景展望

DNA甲基化的年龄预测是表观遗传学的一个快速发展的领域，它有很大的潜力。 在鱼类方面，除了上文提到的关于驼背大麻哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha)的研究外，最近一项以斑马鱼为模型的全基因组研究发现， 斑马鱼的基因组在体细胞中逐渐明显地失去了甲基胞嘧啶， 而且年龄依赖性的低甲基化优先发生在一个与脊椎动物基因有关的特定区域，称为CpG岛岸（CpG island shore），同时还发现斑马鱼卵母细胞中两个低甲基化的CpG岛海岸在受精卵中被从头甲基化， 这表明斑马鱼的表观基因组在受精后被重置，使新一代的基因组重甲基化[15]。 此外， 一项使用大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha) 和候选基因的研究表明，DNA甲基化的变化与基因、 组织和年龄有关， 随年龄的增加而降低，而且不同组织类型的甲基化模式不同[16]。 最近，在关于虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的研究中发现，低甲基化在较大年龄虹鳟中占优势[17]。 这些结果表明，鱼类与鸟类和哺乳动物一样有基于DNA甲基化随年龄变化规律构建表观遗传时钟来预测年龄发展的潜力。

DNA甲基化是一个可遗传的表观遗传标记，涉及到DNA甲基转移酶(DNMTs)将一个甲基基团共价转移到DNA胞嘧啶环的C-5位置， 形成5甲基胞嘧啶(5mC)，鱼类是冷血动物，它们的5甲基胞嘧啶(5mC)含量比鸟类和哺乳动物等温血动物高， 而且鱼类等脊椎动物5甲基胞嘧啶(5mC)含量与体温成反比[18]。 因此，生活在极地地区的鱼类5甲基胞嘧啶(5mC)含量高，而生活在热带地区的鱼类5甲基胞嘧啶(5mC)含量低。 另一方面，与鸟类或哺乳动物不同，鱼类是冷血动物，生长易受环境因素的影响，具有不确定性，其中最重要的是温度，在鱼类中，高于正常温度会加速生长，由于鱼类的生长是不确定的，其繁殖力也随年龄的增长而增加。 这些不确定性，即不同的5mC含量和不确定的生长， 增加了DNA甲基化应用于鱼类年龄预测并构建表观遗传时钟的难度和不确定性。

Anastasiadi等在2020年使用一种可以准确知道年龄的欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax），通过靶向亚硫酸氢钠序列从肌肉样本中的4个基因中扩增出48个CPGs，并应用惩罚回归预测年龄，构建了一个鱼类表观遗传时钟[19]，这是冷血脊椎动物中的第一个表观遗传时钟。 这种鱼的表观遗传时钟涉及到年龄预测，其精度是通过平均绝对误差来测量的，从而证明了时钟具有良好的精度， 预测年龄与实际年龄高度相关，这也为其他物种的类似研究作了铺垫。

但值得注意的是， 此次研究构建的是肌肉中的表观遗传时钟，其中从肌肉中取样是致命的。虽然当鱼被解剖时，从肌肉样本来估算鱼的年龄是可以的，但通过非致死取样来预测年龄会更好。因此，对鱼类通过DNA甲基化预测年龄并构建表观遗传时钟的进一步研究应集中于可通过非致死手段获取的组织，如鳍、鳞片等。 其中鳍是非致死取样的理想组织，多年来一直用于各种研究， 因此构建基于鳍的表观遗传时钟应该是未来研究的主要方向。