高原鳅属鱼类线粒体DNA 和微卫星标记开发研究进展

刘云国，张艳珍,2，隋智海，张海光，全先庆，张如华

（1.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000;2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046）

高原鳅属Triplophysa 隶属于鲤形目Cyprinidformes、鳅科Cobitidae、条鳅亚科Nemacheilinae，是条鳅亚科中最大的类群，也是条鳅亚科鱼类中适应于高原高寒环境的一个特殊类群[1,2]。近十几年来，在我国相继发现了许多高原鳅属鱼类[3-12]，目前全世界约有140 个种，主要分布于青藏高原及其周边地区，我国有100 多个种，其中一些种的遗传多样性正遭受威胁[7,13-15]。DNA 分子标记是评价遗传多样性以及资源保护的有力工具。在众多DNA 分子标记中，目前较常用的两种是线粒体DNA（mtDNA）测序技术和微卫星标记。线粒体DNA 是细胞核外能自主复制、转录及翻译的遗传因子。鱼类线粒体DNA 结构简单、分子量小、拷贝数高、进化速度快且存在种群差异多样性、易于扩增测序，为研究系统发育、分子进化和物种起源的重要分子标记。微卫星标记是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6 个核苷酸的串联重复片段构成。重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性且数量丰富，因此微卫星标记应用非常广泛[16]。

1 高原鳅属鱼类线粒体基因测序及其应用

高原鳅属鱼类的线粒体基因组全长16～17 kb，包括13 个蛋白质编码基因，22 个tRNA，2 个rRNA，1 个非编码区域，即控制区（D-loop 区），高原鳅属鱼类的控制区长度范围在917～930 bp 之间。斯氏高原鳅T.stoliczkae[17,18]、细尾高原鳅T.stenura[19]、叶尔羌高原鳅T.yarkandensis[20,21]、玫瑰高原鳅T.rosa[22]和理县高原鳅T.lixianensis[23]等的线粒体基因组的测序已经完成。李太平等[24,25]对小眼高原鳅T.microps线粒体DNA 进行了酶切分析，并克隆了其细胞色素b（cytb）基因序列的全长，研究了其遗传多样性。何德奎等[2]通过cytb 基因研究了高原鳅属鱼类的分子系统发育，探讨了青藏高原水系高原鳅产生遗传分歧的生物地理学过程。贺刚等[26]采用7 种同工酶凝胶电泳研究了沅江水系湘西盲高原鳅T.xiangxiensis 群体的遗传多样性，结果表明，湘西盲高原鳅遗传多样性较低，这可能与湘西盲高原鳅长期生存在较为封闭的洞穴环境中，群体的遗传结构单一化相关。陶聪[27]分析了六个不同地区的74 尾贝氏高原鳅T.bleekeri 样本的线粒体cytb 基因和控制区DNA 序列，系统聚类分析表明，贝氏高原鳅分为两个进化枝：一是长江流域的种群，另一是黄河流域的种群，并推测我国现行地势的形成以及长江黄河框架的形成对贝氏高原鳅各群体间的遗传差异性产生了重要影响。杨成等[28]基于线粒体cytb 基因序列测序探究了拟硬刺高原鳅T.pseudosderoptera 种群的遗传多样性和分化程度，发现拟硬刺高原鳅宝库河种群遗传多样性低于黄河种群。拟硬刺高原鳅黄河种群和宝库河种群间存在显著的分化，建议在实践中将两个种群分开管理和保护，以达到保护种群遗传多样性的目的。晁燕等[29]利用线粒体cytb 基因全序列分析了拟鲶高原鳅T.siluroides 黄河种群与大通河种群的遗传多样性和分化水平。拟鲶高原鳅黄河种群遗传多样性低于大通河种群，人类活动的影响和外来种引入可能引起了拟鲶高原鳅黄河种群遗传多样性的下降；拟鲶高原鳅黄河种群和大通河种群间存在显著的分化，建议在实践中将两个种群分开管理和保护。Hou 等[30]基于线粒体控制区测序利用5 个野生群体共98 个个体分析了东方高原鳅T.orientalis 种内和种间的遗传多样性差异，并检测其遗传结构和系统进化关系，发现河流群体间的遗传距离比湖泊群体间的遗传距离要大，说明高原湖泊群体的历史基因流较大，三个湖泊创始群体可能产生了瓶颈效应。

等位基因数、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量等都是反映群体遗传基础多样性水平的指标，是基因丰富度的体现，其数值越大，说明基因丰富度越高，遗传潜力越大。姚雁鸿[31]同时运用线粒体cytb 基因和控制区DNA 序列分析了3 个不同湘西盲高原鳅遗传多样性及遗传分化，为保护湘西盲高原鳅提供了依据。张艳萍等[32]用线粒体DNA控制区序列分析了黄河上游玛曲段似鲇高原鳅3个地理种群的遗传多样性和遗传结构，共签定了10个单倍型。遗传分化指数（Fst）统计检验和系统发育树表明，3 个地理群体之间尚未有显著的遗传分化，建议将黄河上游玛曲段似鲇高原鳅群体作为一个整体进行保护。Niu 等[33]分析了玫瑰高原鳅的核型和基因组大小，发现其为二倍体，共48 条染色体，估计的平均基因组大小为（0.88±0.05）pg。高原鳅属鱼类主要分布在青藏高原及其周边地区，迄今为止共发现140 个种，为适应特殊的高原环境，其外部形态变化较大，给形态学鉴定带来了一定的困难。为解决这个难题，Li 等[15]利用DNA 条形码技术鉴定了其中的33 个种共244 个个体，发现大部分种都能形成单独的群组，具有较高的bootstrap 值支持，说明DNA 条形码技术是一种鉴定高原鳅属鱼类的分子标记方法。Feng 等[34]基于形态学和遗传学分化，研究了青藏高原湖泊和河流中短尾高原鳅T.brevicauda 和异尾高原鳅T.stewarti 的进化动力学，发现两种高原鳅在湖泊和河流中的数量比以及形态学和遗传学等都显示了较大的差异。Zhang等[35]利用线粒体DNA 测序方法研究了祁连山区梭形高原鳅T.leptosoma 的地理发生系统学，发现一些梭形高原鳅的分支对地理条件产生了适应性变化。以上研究都为当地高原鳅属鱼类资源的保护提供了重要的遗传参考数据，能够根据遗传多样性水平和地理群体遗传分化情况制定合理的保护管理策略。

2 高原鳅属鱼类微卫星标记开发及其应用

微卫星标记是一种共显性遗传标记，可鉴别纯合子和杂合子；具有丰富的多态性和良好的重复性，比其他显性分子遗传标记如AFLP、RAPD、ISSR等具有更强的遗传检测能力。近十几年来，开发水产生物微卫星标记一直是研究的热点，本实验室也已经开发了多种水产生物的微卫星标记[36-38]。在高原鳅属鱼类的微卫星标记开发上，Yao 等[39]利用FIASCO 方法（AFLP 扩增产物中包含的重复序列）在湘西盲高原鳅中开发了16 条微卫星标记，等位基因数在2～9 之间，遗传学数据表明，它们是进行种质多样性和连锁分析的潜在分子标记。Li 等[18]利用FIASCO 方法通过构建部分基因组文库在前鳍高原鳅T.anterodorsalis 中新开发了10 条微卫星标记，等位基因2～13，显示了较高的遗传多样性。当前，获取微卫星的方法主要有基因组富集文库法、近缘种杂交扩增法、基因组和cDNA 数据库筛选法、基于RAPD、AFLP、ISSR 等扩增序列的筛选法和基于第二代测序技术的全基因组筛选法等。其中，基于第二代测序技术的全基因组筛选法是新近发展起来的一种高通量微卫星标记筛选方法，具有速度快、效率高、成本低的特点。与之前开发微卫星标记较常用的基因组富集文库法相比，因为不需要针对特定微卫星序列的筛选富集步骤，分离的微卫星重复序列类型更加丰富，是一种直接从序列到微卫星（Seq-to-SSR）的筛选方法[40]。Castoe 等[40]利用第二代测序技术，从两种鸟类和一种蛇类上分别测序并筛选到了上万条微卫星序列，通过比较454 测序和Illumina 测序方法，证明了Illumina 双向测序技术是一种经济、高效的微卫星标记筛选方法。Lance 等[41]分别建立了32 种生物的Illumina 双向测序文库，筛选到了大量微卫星标记，进一步验证了该技术在不同物种中应用的可行性。随后，Norrell 等[42]利用Illumina 双向测序技术从红鲷Lutjanus campechanus中开发了84 条微卫星标记，证明了该方法的优势。

近年来，第二代测序技术在高原鳅属鱼类的微卫星标记开发上也得到了应用，如Zhao 等[43]利用454 高通量测序技术在玫瑰高原鳅中开发了11 条微卫星标记，并发现部分位点在近缘种墨曲高原鳅T.moquensis 中能够跨种扩增。Wang 等[44]通过第二代测序对达里湖高原鳅T.dalaica 进行了转录组分析，研究了其适应高原缺氧的分子机理，并筛选到了上万个微卫星序列和SNP 位点。Liu 等[45]利用Illumina Hiseq 2500 测序平台通过转录组测序在玫瑰高原鳅中新开发了9 条微卫星标记，以补充原有微卫星标记的不足。因而，获得的微卫星标记数据，不仅为群遗传多样性评价、遗传结构分析、个体识别、遗传图谱构建等奠定基础，同时也对野生资源的合理开发利用以及今后的遗传育种提供可利用的遗传资料。姚雁鸿[31]利用筛选的16 对微卫星标记分析了湖南湘西龙山县乌龙山的3 个不同洞穴湘西盲高原鳅群体的遗传多样性及遗传分化。16 个微卫星标记在3 个群体中共检测出83 个等位基因，每个基因座检测到3～8 个等位基因。分子变异方差分析（AMOVA）结果表明，遗传变异大部分（92.84%）来自群体内，仅有7.16%来自于群体间，表明3 个群体处于未分化状态，具有较大的遗传一致性。赵金凤等[46]首先测定了高原鳅属13 个物种22 个个体的cytb 基因序列，基于贝叶斯和最大似然法构建了系统发育树，高原鳅属鱼类形成一个单系，玫瑰高原鳅所在的分支位于高原鳅属鱼类的基部。随后采用微卫星标记及cytb 基因测序评估了玫瑰高原鳅的遗传多样性，结果显示：玫瑰高原鳅的遗传多样性处于较低水平。

3 研究展望

目前，线粒体DNA 测序技术和微卫星标记技术已广泛应用到高原鳅属鱼类的遗传多样性和群体遗传结构分析、系统发育进化及保护遗传学研究中。然而由于线粒体DNA 存在结构多样性，且有近缘物种线粒体遗传物质之间发生交流及核DNA 插入的风险，单独使用线粒体DNA 测序技术作为分子标记存在一定的缺陷。微卫星标记自发突变率较高，且无规律可循，在一些种群中突变率很高，而在另一些种群中发生率可能很低，甚至是单态。不同微卫星标记间的突变率不同，也会增加遗传距离和遗传杂合度的估计误差。建议在今后的遗传分析时，线粒体DNA 测序技术应结合微卫星标记联合使用，发挥各自的优点，降低单一DNA 分子标记分析的风险。