褪黑素缓解动物卵母细胞中细胞器氧化损伤的研究进展

2021-12-06田雅晴王婉洁郝海生邹惠影庞云渭赵学明赵善江朱化彬杜卫华

中国畜牧杂志 2021年11期

田雅晴，王婉洁，郝海生，邹惠影，庞云渭，赵学明，赵善江，朱化彬，杜卫华

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，家畜胚胎工程与繁殖创新团队，北京 100193）

体外成熟卵母细胞的质量及其发育潜力显著低于体内卵母细胞[1]，原因是在体外成熟过程中，卵母细胞易受培养液成分、代谢物、温度、湿度、CO2浓度、氧浓度、光照等外界环境因素影响[2]；其中，代谢、光照、高氧浓度和体外操作等均能产生活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），而ROS 过量积累是卵母细胞损伤、成熟质量差，甚至胚胎发育停滞的主要原因[3]。因此，多种抗氧化剂常被添加于卵母细胞的成熟和培养体系中以提高卵母细胞的成熟率和胚胎的体外发育率，以及胚胎质量[4]。

褪黑素（Melatonin）是由哺乳动物和人类松果体分泌的神经内分泌激素，是神经-激素-免疫复杂网络系统中的成员，参与疾病感染、炎症、抗癌细胞增殖和自身免疫等过程[5]。同时，褪黑素也是一种强有力的内源性抗氧化剂，能保护生物免受氧化应激，提高机体的免疫力[6]和抗衰老[7]。对于卵母细胞，褪黑素不仅能通过颗粒细胞参与卵母细胞的成熟调控，而且能通过卵母细胞膜上的褪黑素受体（Melatonin Receptor 1a and 1b，MT1 和MT2）调控卵母细胞的成熟[8]。此外，褪黑素还能调控胞内的线粒体、内质网、纺锤体等细胞器的动态分布，改善其功能，最终促进卵母细胞的成熟及其胚胎的发育[9]。本文围绕褪黑素的抗氧化特性，综述其对卵母细胞及细胞器的保护作用和相关机制的研究进展，为其在动物胚胎生产和动物繁殖中更广泛的应用提供参考。

1 褪黑素概述

作为一种神经内分泌激素，褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色氨酸）广泛分布在大脑、视网膜和胃肠道等机体各部位[10-11]。除调节昼夜节律的功能外，褪黑素还具有免疫调节、抗衰老和抗氧化等作用[12]。褪黑素是高亲脂性和部分亲水性的化合物，可穿过各种生理屏障[13]。褪黑素能有效清除ROS，增强细胞内抗氧化酶活性，从而缓解过量ROS 对脂质、蛋白质和DNA 的损伤[14]，抵抗氧化应激，维持细胞稳态[15]。此外，褪黑素还可以通过其特异性受体MT1 和MT2 调节多种生理过程[16]。

2 褪黑素对卵母细胞及其细胞器的抗氧化保护

家畜卵母细胞的成熟对早期胚胎的发育至关重要，而卵母细胞的成熟包括核成熟和质成熟，其中质成熟分为细胞器成熟和分子成熟2 个方面。细胞器成熟是指在卵母细胞成熟过程中，细胞器的位置发生动态变化，如皮质颗粒迁移到皮质区、线粒体向胞质中央区扩散、高尔基体和粗面内质网消失等。褪黑素易于穿透细胞膜，分布在细胞器中清除ROS，发挥保护作用，并维护细胞内环境的稳态。

2.1 褪黑素对卵母细胞的保护已有研究表明，在牛、羊、猪和小鼠等动物的卵母细胞体外成熟过程中添加褪黑素会促进卵母细胞发育[17]，在小鼠卵母细胞的成熟液中添加10-6mol/L 褪黑素后卵母细胞的成熟率提高21%[18]。另外，褪黑素能保护卵母细胞免受有毒物质产生的大量ROS 所造成的氧化损伤[19]。苯并芘（Benzo（a）perylene，BaP）是广泛存在于环境中的致癌物，可使猪卵母细胞的体外成熟率从66%降低到23%，受精率从62%降低到27%；体外成熟液中添加褪黑素后，卵母细胞的成熟率和受精率分别提高到56%和47%，有效改善了暴露在BaP 环境中猪卵母细胞的质量[20]。另外，褪黑素可清除猪卵母细胞衰老过程中产生的ROS，抑制促凋亡基因BAX和BAD的表达，减少卵母细胞凋亡，改善其质量[21]。

2.2 褪黑素对线粒体的保护线粒体是细胞中合成三磷酸腺苷（Adenosine Triphophate，ATP）的细胞器，参与细胞分裂、分化、凋亡等活动[22]。线粒体的分布、膜电位（Mitochondrial Membrane Potential，MMP）及其DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数是判断线粒体功能和卵母细胞质量的重要指标。卵母细胞阶段，早期的线粒体为圆形或椭圆形，主要分布于皮质区；卵母细胞成熟后，线粒体向胞质中心扩散，均匀分布于核周围。

在卵母细胞中，线粒体内的褪黑素浓度最高，有维持线粒体正常功能的作用[23]。研究发现，褪黑素能使牛卵母细胞中线粒体的正常分布率提高10%，mtDNA拷贝数增加，线粒体活性增强[24]。鱼藤酮（Rotenone）是一种广泛应用的农业杀虫剂，可诱导线粒体毒性，进而破坏生殖系统，影响卵母细胞成熟、排卵和受精；而褪黑素不仅可以增加线粒体MMP，促进ATP 的产生和降低ROS 水平，还可以提高线粒体发生基因沉默信息调节因子1（Silent Information Regulator l，SIRT1）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγCoacti vator-1α，PGC-1α）的表达，降低线粒体的氧化应激和细胞凋亡率，最终消除鱼藤酮诱导的线粒体功能异常、ATP 缺乏和胚胎发育障碍[25]。胞内Ca2+含量是反映线粒体功能的重要指标之一，MMP 和Ca2+的储存与许多维持细胞内稳态的线粒体过程密切相关，Ca2+含量过高会导致线粒体和细胞的损伤[26]。10-5mol/L 褪黑素处理可诱发人卵母细胞中Ca2+水平降低和MMP 升高，表明褪黑素对线粒体功能的保护作用[27]。猪卵母细胞成熟过程中褪黑素能逆转黄曲霉素B 对mtDNA 复制和线粒体发生的抑制作用，进而恢复线粒体的正常功能和卵母细胞的正常成熟[28]。小鼠卵母细胞线粒体中合成的大量褪黑素通过提高mtDNA 拷贝数、MMP 值、线粒体正常分布率、ATP 合成和纺锤体的正常装配来改善线粒体的功能，促进卵母细胞的体外成熟[29]。

2.3 褪黑素对内质网的保护内质网是细胞中重要的细胞器，包括滑面内质网和粗面内质网[30]，前者负责Ca2+的储存及调节、脂质合成，后者负责蛋白质的合成、折叠、修饰及转运[31]。在卵母细胞成熟过程中，粗面内质网逐渐减少，成熟后完全消失，滑面内质网数量增加。内质网的分布随卵母细胞发育阶段的不同而动态变化，在生发泡（Germinal Vesicle，GV）期卵母细胞中，内质网由微管和动力蛋白的作用均匀分布在细胞质[32]；在第2 次减数分裂中期（Metaphase II，MII）期时，由微丝作用使内质网呈网状网络延伸到整个细胞，但主要集中分布于皮质区[33]。在胁迫条件下，内质网内蛋白质合成、运输障碍或Ca2+的摄取/释放紊乱时，其腔内堆积的大量未折叠或错误折叠的蛋白将引起内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS），并诱导未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），导致卵母细胞老化、凋亡，降低动物繁殖力[34]。所以，内质网的重新分布和结构变化是卵母细胞胞质成熟的标志。

在体外培养过程中，多种因素都能影响卵母细胞中内质网的功能和蛋白质合成，导致ERS 和UPR 信号通路激活[35]。研究发现，褪黑素能促进牛卵母细胞成熟过程中内质网的正常分布，提高受精率和发育率[9]。另外，ERS 通常伴随着其他应激反应，尤其是氧化应激[36]。ERS 本身诱导ROS 的产生，而ROS 也参与ERS 和UPR 信号激活[37]。猪卵母细胞内ROS 增加会破坏内质网的重新分布和Ca2+的动态平衡，影响卵母细胞的胞质成熟[38]。在猪卵母细胞的体外成熟过程中，UPR基因的表达逐渐增强，激活UPR 信号通路；而褪黑素不仅通过调节UPR 信号通路来减轻ERS，促进猪卵母细胞成熟[39]，还可抑制ERS 标志基因CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhancer Binding Protein Homologous Protein，CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78）的表达，缓解棕榈酸诱导的小鼠颗粒细胞凋亡[40]。氧化应激通过引起ERS 诱发人子宫内膜异位症患者中卵巢颗粒细胞的衰老，并造成不孕；而褪黑素处理能缓解颗粒细胞ERS、细胞衰老、MMP 和ATP 异常，可作为该不孕症的辅助治疗方法[41]。可见，褪黑素通过抑制ERS 来保护卵母细胞，减少细胞凋亡和死亡。

2.4 褪黑素对纺锤体的保护纺锤体是由微管、着丝粒和染色体组成的细胞器，负责细胞分裂时染色体的准确分离[42]。在有丝分裂中，纺锤体由中心体成核的微管形成，而减数分裂中的纺锤体没有中心体，因此卵母细胞中纺锤体的形成由着丝粒和微管组织中心主导[43]。纺锤体对卵母细胞染色体的排列、分离和极体的排出具有重要意义[44]，同时纺锤体出现是卵母细胞成熟的标志[45]。

由脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）引起的氧化应激使小鼠卵母细胞中乙酰化微管蛋白的水平显著降低，进而破坏动粒与微管的附着和纺锤体形成，诱发同源染色体排列和分离异常；而褪黑素能改善DON 诱发的各种异常表现，纺锤体正常形成[46]。广泛存在于食物中的赭曲霉毒素（Ochratoxina，OTA）通过阻滞细胞分裂周期蛋白（Cell Division Cycle 2，CDC2）介导的细胞周期进程而影响卵母细胞极体的排出，同时通过降低丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）的表达而破坏纺锤体的形成；褪黑素处理后猪卵母细胞的纺锤体正常形成，细胞周期进程也恢复正常[47]。小鼠的重复超数排卵诱发卵母细胞的氧化应激，影响纺锤体组装，显著降低成熟率；而褪黑素能有效改善卵母细胞质量[48]。另外，褪黑素能缓解冷冻-解冻过程导致的小鼠卵母细胞中纺锤体形态异常，提高纺锤体组装检验点相关基因的表达，例如单极纺锤体蛋白激酶1（Monopolar Spindle 1，MPS1）、苯并咪唑出芽抑制解除物蛋白1 相关激酶（Budding Uninhibited by Benzimidazoles 1 Related Protein Kinase，BUBR1）、有丝分裂阻滞缺陷蛋白1（Mitotic Arrest-Deficient Protein 1，MAD1）和MAD2，提高解冻后卵母细胞的体外成熟率[49]。再者，褪黑素通过SIRT2调控的H4K16 去乙酰化途径改善猪老化卵母细胞中纺锤体和染色体的异常装配，及异倍体后代的产生[47]。所以，褪黑素是保护纺锤体免受氧化应激损伤的重要物质。

2.5 褪黑素对皮质颗粒分布的影响皮质颗粒是卵母细胞特有的细胞器，来源于高尔基体或滑面内质网[50]，圆形、外包质膜，其中含多种酶和糖基化物质，与防止多精受精有关[51]。GV 期的牛卵母细胞中，皮质颗粒成簇分布在胞质，在MII 期则迁移至皮质区[52]。所以，皮质颗粒的正常分布是卵母细胞成熟的特征，其异常分布会降低胞质成熟的质量，造成多精受精而导致流产。

皮质颗粒迁移和分布依赖于微丝的结构蛋白——肌动蛋白、肌球蛋白及微丝的网络系统[53]。暴露于百草枯（Paraquat，PQ）的牛卵母细胞中，皮质颗粒分布异常的比例增加，胞质成熟质量下降，导致受精时无法进行正常的皮质颗粒胞吐，受精能力和胚胎发育能力降低；而褪黑素能够有效改善皮质颗粒的异常分布，提高卵母细胞的成熟率和胚胎发育能力[54]。老化的小鼠卵母细胞存在皮质颗粒密度显著减少、透明带硬化程度增加和受精能力下降等问题，而褪黑素能够显著改善上述情况，同时降低胞内ROS 水平，抑制细胞凋亡，提高其受精能力，延缓卵母细胞老化[55]；褪黑素也能够显著降低纺锤体的异常组装和皮质颗粒异常分布的老化牛卵母细胞的比例，改善卵母细胞质量[56]。BaP 通过损伤减数分裂相关的细胞器如纺锤体的装配、肌动蛋白的动力特性和线粒体的完整性等造成猪卵母细胞不能恢复减数分裂，同时引发皮质颗粒和卵磷脂的异常分布，导致卵母细胞的受精率低下；而褪黑素能减轻BaP 带来的负面影响，提高卵母细胞的体外成熟质量，减轻环境对动物繁殖系统的毒害作用[20]。