基因编辑技术在家畜育种中的研究进展

邹菊红，邹剑伟，申玉建，冯雪萍，连子童，徐建建，宋 颖，胡 艳，张 瑜，黄艳娜，蒋钦杨

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004）

基因编辑技术是对生物体基因组 DNA 进行特异性修饰的技术，其对DNA 的修饰有精确敲除、定点插入或诱导突变等，可以使被编辑的生物体性状发生定向改变，并且能够稳定遗传给后代，被广泛应用于生物医药、动物遗传育种、基因工程和植物分子育种等领域。锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白 9（CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）是3 种 不同的基因编辑工具。在家畜遗传育种方面，利用基因编辑技术进行定点基因编辑可以大大缩短家畜选育时间，加快育种进程，还能对物种性状改良进而诱导突变理想性状，且安全性有一定保障[1]。本文重点阐述3 种基因编辑技术在家畜育种中的应用，对提高肉品质、减少动物过敏源产品、构建疾病模型等方面的应用研究进展及前景作简要概述。

1 基因编辑技术概述

基因编辑技术是一种对细胞内DNA 进行序列特异性修饰的工程技术，修饰包括对DNA 片段的插入、删除、序列替换等。DNA 损伤的修复机制以及由此引起的DNA 结构变化研究已经成为有针对性的基因编辑的基础[2]。锌指核酸酶最早于1995 年被发现，它是一种细菌蛋白质的DNA 切割域和最初在序列特异性真核转录因子中鉴定的锌指杂交产物，通过对锌指蛋白特异性识别的DNA 序列进行切割引入双链断裂（Double-Strand Break，DSB）[3]。2010 年，科学家发现来源于植物病原菌的转录激活子，其与限制性核酸内切酶连接后被命名为TALENs。TALENs 使用和ZFNs 相同的细菌切割域，将其与植物病原菌产生的转录因子的DNA 识别模块相结合来达到基因编辑的目的。1987 年，日本科学家首次在大肠杆菌基因组中发现CRISPR/Cas9 系统，它是一种获得性免疫的原核系统，由规律成簇间隔短回文序列和CRISPR 相关蛋白9（Cas9）组成。CRISPR技术通过DSB 修复途径，碱基编辑，可以诱导基因的定性表达和定量改变。另外，基因编辑技术可以与其他技术（如体细胞克隆技术）结合，制备出具有重要经济价值或医学研究价值的基因编辑动物，在动物遗传育种和人类疾病研究等领域具有广阔的前景[4]。

2 基因编辑核酸酶的基因结构和作用原理

2.1 ZFNs ZFNs 是锌指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）的DNA 结合结构域与FokI 核酸内切酶的切割结构域融合而形成[5]。ZFN 的序列特异性源自ZFP 区域，该区域包含3～6 个锌指，每个锌指可以识别1 个三联体核苷酸代码[6]。典型的锌指由30 个氨基酸组成，形成2 个与α螺旋相对的反平行β折叠。该结构域由结合锌离子的2 个半胱氨酸和2 个组氨酸残基来稳定，形成致密的球形结构域，可以将多个锌指结合在一起形成更大的锌指蛋白DNA 识别域，从而增加特异性和编辑效率。锌指的特异性结合在很大程度上是独立的，但是相邻锌指之间的某些接触会改变碱基对的识别。非特异性核酸内切酶FokI 必须二聚化形成功能性二聚体才能切割双链DNA。

2.2 TALENs TALE（转录激活因子样效应物）是由植物病原体自然产生的，例如革兰氏阴性细菌黄单胞菌，可以感染胡椒、水稻、柑桔、棉花、番茄和大豆等多种植物[7-8]。TALE 与宿主DNA 结合，充当转录因子并激活有助于细菌感染的植物基因表达。单个TALE 重复序列可用于构建识别哺乳动物细胞内源序列的DNA 结合域，通过将该结合域与II 型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域相连接成TALEN 工具[9-14]。TALENs 由重复序列组成，每个重复序列由33～35 个氨基酸组成，在重复序列的12 和13 号位点氨基酸残基具有多态性，称为重复可变双残基（Repeat Variant Di-Residues，RVDs），负责识别特定核苷酸[15]。具有不同特异性的RVD 可以组装成不同阵列，以靶向不同的DNA 序列。1 个RVD 特异性结合基因组DNA 的1 个核苷酸[16]，因此为蛋白质与DNA 的相互作用建立了一对一关系。TALENs 可成功用于靶向内源基因并有效切割哺乳动物的DNA，已被用于敲除大鼠和斑马鱼以及牛、绵羊和猪的基因[17-19]，有效诱导不同物种的遗传修饰[20]。

2.3 CRISPR/Cas9 系统 CRISPR 和CRISPR 相关（Cas）蛋白是一种可遗传的、适应性强的原核生物（细菌和古细菌）的免疫系统，可为它们提供先前病毒感染的记忆力和防御再次感染的能力[21]。CRISPR/Cas 系统有I 型、II 型、III 型、IV 型和V 型，在功能上又分为I 类和II 类[22]。Ⅰ类系统是有着多重亚基靶标特异性CRISPR RNA 的效应子复合物，包括I、III、IV 型，II类系统的效应子复合物都是 Cas9，包括Ⅱ和Ⅴ型[23]。II 类（CRISPR/Cas9）系统是 CRISPR/Cas 系统中最简单，也是现在研究最为深入、应用最为广泛的系统[24]。通过开发II 类CRISPR/Cas9 核酸酶系统实现了基因组编辑的常规实践。如2013 年化脓性链球菌的II 型Cas 蛋白（SpCas9）用于RNA 引导的DNA 切割在哺乳动物细胞中首次使用，奠定了CRISPR/ Cas9 作为广泛适用的基因组编辑工具的基础[25]。CRISPR/Cas 系统由Cas9核酸内切酶和单链向导RNA（sgRNA）组成，sgRNA为20～30 bp 的核苷酸，其又包含靶标特异性CRISPR RNA（crRNA）和辅助反式激活RNA（tracrRNA）2个成分[26-27]。crRNA 和tracrRNA 激活并引导Cas 蛋白结合病毒DNA 序列，随后将其切割，使靶序列双链断裂（DSB）[28]。在切割目标DNA 之前，Cas9 核酸酶与sgRNA 结合后会发生构象变化并定向到其目标位点[29]。原间隔子相邻基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）是CRISPR/Cas 系统必不可少的靶向组件，可以识别自我或者识别非自我系统，防止本身CRISPR 被靶向编辑。DSB 通过非同源末端连接（Nonhomologous End Joining，NHEJ）和同源重组（Homologous Recombination，HR）2 种修复机制进行修复。真核生物通过非同源末端连接修复，原核生物通过同源重组修复或其他修复途径。非同源末端连接（NHEJ）是一种易于出错的修复机制，通常会导致片段插入或缺失，这就可以实现外源基因的定向敲入及敲除，但可能发生过早终止密码子而导致基因功能丧失的情况[30]。而同源重组（HR）使用DNA供体模板的辅助重组来重建裂解的DNA，通过将供体模板转移到靶细胞中可以引入定义明确的突变[31]。

3 3 种基因编辑工具的异同

对人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞以及3 种不同靶基因AAVS1、OCT4和PITX3的比较研究表明，TALEN 和ZFN 具有类似的靶向效率[32]。ZFN 与TALEN 的不同体现在3 个方面：一是TALEN 重复序列对目标DNA 每个碱基对的识别是ZFN 的3～4 倍；二是TALEN 间隔子长度（2 个结合位点之间的间隔）是可变的且不限于特定长度，这会使TALEN 设计复杂化，并且相对于具有固定间隔子长度的ZFN 核酸酶而言，可能导致更大的脱靶性；三是ZFN 需要有更高质量、功能明确的模块区域来组装，这样才能实现特定的基因靶向编辑[33]，而TALEN 各重复单元之间具有上下相关效应，可以结合起来潜在地识别靶序列[34]，因此TALEN 在设计和组装的难易程度、成本优于ZFN。另外在一项研究展示了相对简单的TALEN 装配，报告了18 740 种人类不同蛋白质编码基因的TALENs 文库构建方式[35]。

CRISPR/Cas 系统本质上是RNA 引导的核酸酶。与ZFN、TALEN 通过蛋白质-DNA 相互作用识别靶序列的核酸酶不同，CRISPR/Cas 核酸酶是通过RNA 和DNA 碱基配对来识别靶序列。CRISPR/Cas9 提供了一种更低成本、高效且易于使用的基因编辑系统。与TALENS 相比，CRISPR 采用易于传递的小蛋白质，更快捷；与ZFN 相比，CRISPR 不需要成对的蛋白质即可靶向特定基因座，更方便[36-37]。CRISPR/Cas 除了具有一次性促进多重基因组修饰的能力外，与其他2 种DNA核酸酶相比设计要容易很多，使用CRISPR/Cas9 技术也为复杂的多基因疾病研究带来新的可能与突破[38-39]。

4 基因编辑技术在家畜育种中的应用

4.1 在疾病抵抗中的应用 疾病是制约畜禽业发展的重要因素之一，严重影响畜禽的健康和养殖效益。CD163是富含清除剂受体的半胱氨酸超家族（SRCR）的成员，作为PRRSV 的结合受体，其第7 外显子的SRCR5 结构域是感染猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒的关键。Burkard 等[40]使用CRISPR/Cas9 敲除CD163 受体而产生抗PRRS 病毒的猪。CD163-KO 猪不仅可以完全免受PRRS 感染的所有症状的侵害[41]，而且在农业中使用经基因编辑CD163-KO 猪可大大减少PRRS 相关的经济损失。牛结核病是牛感染分枝杆菌病原体引起的人畜共患病，Gao 等[42]使用Cas9 内切酶将NRAMP1基因（对细胞内病原体1 的感染具有天然抵抗力）插入牛基因组，插入的NRAMP1 可以在牛基因组中正确表达，进而提高牛对分枝杆菌感染的抵抗力。Lillico 等[43]使用ZFN将来自疣猪的等位基因（与非洲猪瘟抵抗力相关）引入到普通猪中，使自然繁殖条件下产生的猪获得了抵抗非洲猪瘟的能力。Liu 等[44]使用ZFN 将人类溶菌酶（Hlyz）基因插入到牛β-酪蛋白基因座中，从而使该牛的乳腺可以分泌人溶菌酶，该酶溶入牛的乳汁具有杀死金黄色葡萄球菌的能力。Lee 等[45]使用CRISPR/Cas9 技术对鸡B 亚型肿瘤病毒基因(TVB)进行编辑，使该基因受体中含有半胱氨酸结构域的位点产生终止密码子而无法表达，从而使鸡抵抗B 亚型白血病肿瘤病毒的感染，建立了抗B 亚型白血病的鸡细胞系。

4.2 在性能提升上的应用 肌肉生长抑制素基因（Myostatin，MSTN）属于生长激素家族的负调节基因，其能抑制动物肌肉卫星细胞的更新和增长，从而抑制骨骼肌生长。天然存在MSTN-KO 表型的有比利时蓝牛、皮埃蒙特牛和特塞尔羊。Bi 等[46]利用CRISPR/Cas9 技术结合Cre/LoxP 重组系统引入了精确突变编辑猪的MSTN基因，发现MSTN基因敲除的猪骨骼肌中成肌基因表达增加，骨骼肌发育增强，肌纤维数量提高，背最长肌增大，背脂肪厚度减小，在一定条件下可以产更多的肉。目前在一些普通动物（如兔、绵羊、山羊、牛）中也成功诱导了MSTN-KO 表型[47-48]，这些动物在视觉上与野生型个体明显不同的是肌肉量多，在肌肉的组织学比较中也可以观察到[49-50]。脂肪酸脱氢酶1（Fat1）基因的翻译产物是n-3 多不饱和脂肪酸脱氢酶，可以将多不饱和脂肪酸从n-6 转化为n-3 形式，人体自身不能合成n-3 多不饱和脂肪酸，只能从食物中获得。Tao 等[51]使用ZFN 技术将外源的Fat1基因成功插入到猪基因组中，该猪产生的肉与未被编辑过的猪相比有着更高的n-3 多不饱和脂肪酸。NANOS2是严格的雄性生殖特异性基因，与雄性生育能力有关，缺少该基因的公猪能够健康生长，但会表现出不育。利用CRISPR/Cas9 把猪携带的NANOS2基因敲除[52]，在被敲除NANOS2基因的普通公猪中植入来自其他优良公猪的精原细胞（即产生精子的干细胞）后，普通公猪开始产生优良公猪的精子，这就使得具有遗传优势的雄性生殖细胞在普通公猪体内保留下来，有助于扩大遗传潜能，培育具备优良性状的牲畜。

4.3 在减少过敏源动物产品上的应用β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）基因编码的乳清蛋白是山羊和其他反刍动物乳中的主要乳清蛋白，在人乳中通常不存在，也是主要的人过敏源[53]。使用ZFN 技术剔除山羊BLG基因后，所产的牛奶蛋白质含量明显改变，乳清蛋白水平降低，酪蛋白水平升高[54]。因为缺乏构成羊奶主要致敏成分的BLG，羊奶也能被更多原本不能适应羊奶的消费者所接受。人乳铁蛋白（hLF）是一种参与肠道铁吸附和非特异性免疫反应的糖蛋白。Cui 等[53]利用TALEN 技术把山羊BLG基因敲除，使该山羊作为乳腺生物反应器，用于大规模生产hLF，他们利用经TALEN 诱导的同源重组靶向载体，将hLF基因导入BLG 位点，在山羊基因组中分别以13.6% 和6.09% 的频率进行了基因修饰，发现基因修饰后杂合子山羊乳中hLF 大量存在而BLG 含量较低，纯合子山羊乳中完全不含BLG，并且山羊体细胞中TALEN 所介导的这种基因修饰可以通过体细胞核移植技术（SCNT）传递给后代。Oishi 等[54]使用CRISPR/Cas 系统敲除了产生卵清蛋白和卵黏蛋白的基因，旨在从蛋清中去除这两种致敏成分，使得对鸡蛋过敏的人可以放心吃鸡蛋。

4.4 建立动物模型 基因编辑技术大大提高了基因的突变效率，降低了基因修饰动物模型的造模成本，利用基因编辑技术（或与其他技术相结合）可以成功建立人类疾病模型。外异蛋白A 受体（EDAR）调控着动物毛囊的生长发育，在小鼠中该基因突变导致毛发的缺失。Hao 等[55]使用CRISPR-Cas9 编辑生成了携带EDAR基因的突变体山羊，该品种山羊毛囊异常，头顶没有毛发，这项研究为EDAR基因相关表型和毛囊生长与发育的未来研究提供了有价值的动物模型。Lee 等[56]使用TALEN 技术编辑猪重组激活基因2（RAG2）产生了免疫缺陷型猪，该模型可用于医学上对免疫缺陷疾病的研究。Kang 等[57]使用 CRISPR/Cas9 靶向编辑了猪肿瘤抑制基因RUNX3，RUNX3-KO 猪可作为模型为人类肿瘤疾病和癌症的研究做贡献。

5 总结与展望

基因编辑技术解决了家畜育种周期长和遗传资源少等问题，大大缩短育种周期，降低育种成本并迅速增加了遗传多样性。当前，已经产生了许多基因编辑的家畜，如抗PRRS 的基因编辑猪、MSTN基因编辑的猪和对结核病不敏感的转基因牛等。一些经过基因编辑的家畜在瘦肉率、抗病性和其他有利性能方面也得到显著提高。不同的基因编辑工具各有优缺点，选择特定系统似乎更多地取决于研究人员的专业知识，而不仅仅是这项技术本身。另外，当前的基因编辑技术（CRISPR/Cas9）还面临着脱靶问题，具有在基因组中诱导脱靶突变的潜力，这些突变也许不会对动物个体健康产生影响，但仍然不可忽视。最近科学家发现了新的CRISPR 相关蛋白，其中Cas12a 介导的基因编辑可以显著降低脱靶率，这也是基因组编辑技术向前迈出的一步。总而言之，基因编辑是有价值的工具，这些技术的扩展激发了研究者探索和改变家畜基因组的潜力，借助基因编辑工具，家畜育种将进入新的发展机遇，并为人类提供更高质量、更健康、更低成本的品种和更丰富的产品。