多靶点粪便DNA检测技术在结直肠癌筛查中的应用价值研究进展*

贺子轩，沈振，顾伦，柏愚

海军军医大学第一附属医院消化内科 上海 200433

结直肠癌是全球范围内发病率排名第三位的恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大病因，每年有近190万新发病例，占癌症总发病人数的9.8%，新发死亡病例近93.5万，占癌症总死亡人数的9.2%[1]。预计到2030年，全球新发结直肠癌病例将超过220万，死亡病例将超过110万[2]。对平均风险人群开展筛查可以降低结直肠癌的发病率和死亡率[3-4]。目前，结肠镜检查是早期诊断结直肠癌最准确的筛查方法，但该方法也存在一定的局限性。首先，与左半结肠相比，右半结肠的病变检出率较低[5-9]。其次，不同内镜医师的结肠镜检查质量参差不齐，导致腺瘤检出率差异很大[10-12]，这在右半结肠中尤为明显[13]。再者，由于饮食限制和侵入性检查，患者对结肠镜检查的依从性较低[14-15]。

在无创筛查手段中，基于愈创木脂的粪便潜血试验（fecal occult blood test，FOBT）以及检测敏感性更高的粪便免疫化学检测（fecal immunochemical test，FIT）被证实可降低结直肠癌相关的死亡率，但对进展期结直肠腺瘤或早期结直肠癌的诊断敏感性都相对较低[16-17]。此外，有研究表明，近三分之一的结直肠癌由无蒂锯齿状病变（sessile serrated lesion，SSL）演变而来，且多为非出血性，主要发生在右半结肠，因此FOBT和FIT对SSL的诊断价值十分有限[18-19]。

1 粪便DNA检测技术的建立与发展

结直肠癌的发生、发展是一个多步骤、多因素、多阶段的过程，其中包括细胞基因组及表观遗传学改变的不断积累[20-22]。在细胞的表观遗传修饰过程中，DNA异常甲基化是肿瘤发生过程中一个早期、常见、稳定的事件，肿瘤细胞脱落进入肠腔并与粪便混合，在粪便中可以检测到极少量的DNA片段，可用以检测肿瘤细胞DNA的异常甲基化[23]。早在1992年，Sidransky等[24]从人类粪便中纯化出DNA，并在结直肠癌患者的粪便中发现了KRAS基因的突变，为建立结直肠癌的无创诊断方式奠定了坚实的理论基础。随后，p53、APC、SPG20、SFRP2等突变基因在粪便中相继被发现并运用于结直肠癌的早期检测。近年来，随着肿瘤分子诊断机制探索的不断深入和粪便DNA检测技术的不断进步，研究人员逐渐认识到，检测粪便中单个基因的突变或异常甲基化并不能准确反映肠道细胞的DNA变异。为了提高检测敏感性，多靶点粪便DNA检测（MT-sDNA）技术应运而生。

MT-sDNA于2000年首次被提出。Ahlquist等[25]通过对结直肠癌、腺瘤直径>1 cm和结肠镜检查结果阴性的患者的粪便样本进行DNA提取和检测，检测靶点包括KRAS、p53、APC以及一种可扩增的微卫星不稳定性标志物Bat-2，结果显示MT-sDNA对结直肠癌的检测敏感性为91%，对直径>1 cm进展期腺瘤的检测敏感性为82%，特异性为93%。该研究极大地鼓舞了后续更多研究的开展，鉴于MT-sDNA对结直肠癌及进展期腺瘤具有较高的检测敏感性，美国癌症协会（ACS）在2008年将其纳入结直肠癌筛查指南。

2 MT-sDNA的研究进展

Imperiale等[26]于2014年发表了一项关于MT-sD⁃NA在结直肠癌筛查中检验效能的研究（DeeP-C研究），该研究纳入了近10 000名50～84岁的结直肠癌平均风险受试者作为研究对象，并对其粪便样本分别进行MT-sDNA（包括KRAS突变、NDRG4和BMP3异常甲基化、β-actin以及血红蛋白免疫分析）与FIT检测，且所有受试者均接受结肠镜检查以明确最终诊断。结果显示，MT-sDNA对结直肠癌的检测敏感性为92.3%，对晚期癌前病变（包括进展期腺瘤及直径>1 cm的SSL）的检测敏感性为42.4%，均高于FIT的检测敏感性（分别为73.8%和23.8%）；而对于非进展期腺瘤，FIT检测特异性（94.9%）则优于MT-sDNA检测（86.6%）。基于这项研究，MT-sDNA试剂盒（Cologuard）在同年获得了美国食品药物监督管理局（FDA）的批准，并被纳入美国医保，用于结直肠癌平均风险人群的筛查。

随后，Redwood等[27]于2016年发表了与DeeP-C研究的设计思路和检测靶点相同的一项研究，该研究共纳入661名40～85岁的阿拉斯加州的结直肠癌无症状平均风险受试者作为研究对象，比较MT-sDNA和FIT对结直肠肿瘤的诊断效能，以结肠镜检查作为最终诊断标准。总体而言，MT-sDNA的结直肠癌检测敏感性（49%）高于FIT（28%），但MT-sDNA的结直肠癌检测特异性（93%）低于FIT（96%）。另外，该研究还发现MT-sDNA的检测敏感性随着腺瘤大小的增加而增加（直径≥3 cm时，检测敏感性达到80%），并且对不同大小的腺瘤检测敏感性均高于FIT。其中，对于直径≥2 cm的腺瘤和直径≥1 cm的SSL，MT-sDNA的检测敏感性分别为62%和67%，而FIT仅为29%和11%。同年，美国预防服务工作组（USPSTF）也将MT-sDNA纳入结直肠癌筛查指南，并建议50～75岁的无症状平均风险人群每3年进行一次MT-sDNA筛查[28]。

继Redwood等研究之后，Bosch等[29]在2019年发表了一项比较MT-sDNA和FIT对结直肠晚期癌前病变的检验效能的研究，该研究纳入1 047名50～75岁的阿姆斯特丹和鹿特丹地区的结直肠癌无症状平均风险受试者作为研究对象，检测靶点与上述两项研究一致，结果显示MT-sDNA对结直肠晚期癌前病变的检测敏感性为46%，高于FIT的27%。在结肠镜检查结果阴性或非晚期癌前病变的诊断方面，MT-sDNA的检测特异性为89%，低于FIT的93%。另外，该研究还发现，MT-sDNA对多个病变、较大的病变和具有绒毛管状结构的病变的检测敏感性更高。该研究与DeeP-C研究和Redwood等研究的结论基本一致。

SSL进一步发展可能演变为结直肠癌，而FOBT和FIT对SSL的诊断敏感性较低，为了验证MT-sDNA对于SSL的检验效能，Heigh等[30]对456名（中位年龄61岁）无症状结肠镜受检者分别进行MT-sDNA和FIT检测，结果显示对于直径≥1 cm的SSL，MT-sDNA的检测敏感性为55%，特异性为91%；而FIT则基本无法有效检出SSL。这一结果也再次证实了MT-sDNA在结直肠癌筛查中的应用价值。还有其他一些研究，例如，Eckmann等[31]于2020年开展了一项回顾性队列研究，研究对象为2014—2017年在美国Mayo Clinic各级医院完成MT-sDNA（Cologuard）检测的所有受试者，结果显示无论受试者之前是否接受过结肠镜检查，MT-sDNA对结直肠癌或癌前病变都具有较高的阳性预测值（67%），且MT-sDNA结果呈阳性的患者中有79%的患者在结肠镜检查中发现右半结肠癌变，这一结果也体现了MT-sDNA与其他结直肠癌无创筛查方式相比所具有的潜在优势。再如，Cooper等[32]对30名MT-sDNA结果阳性而结肠镜检查结果为阴性的患者进行了后续调查研究，发现12名患者在11～29个月后再次接受MT-sDNA，其中5名患者检测结果仍然呈阳性，且有3名患者在随后的结肠镜检查中发现了癌前病变（腺瘤或SSL）。这表明，MT-sDNA结果持续阳性可能提示结肠镜检查时漏检病变。

随着结直肠癌无创筛查方法的发展和创新，我国也针对适龄筛查人群开展了MT-sDNA临床试验。Li等[33]对89名结直肠癌患者及30名结肠镜检查结果阴性受试者的粪便进行SNCA和FBN1甲基化检测，结果表明MT-sDNA检测结直肠癌的敏感性为84.3%，特异性为93.3%。武曼群等[34]对我国宁夏地区的300名接受结肠镜检查的患者进行FOBT及MT-sDNA研究，发现MT-sDNA对结直肠癌的检测敏感性为80.95%，特异性为86.54%，阳性预测值为53.1%，阴性预测值为81.77%，敏感性及特异性均优于FOBT。Yang等[35]对151名结肠镜检查受试者的粪便分别进行FOBT和MT-sDNA，检测靶点为KRAS、NDRG4、SDC2和TFPI2，结果显示MT-sDNA对于结直肠癌及进展期腺瘤的检测敏感性分别为90.0%和70.6%，其中，MT-sDNA对结直肠癌的特异性为94.0%，均优于FOBT。这些研究的结果与上述面向欧美人群的大样本临床研究结论基本一致，但仍需要开展更多基于我国人群的高质量临床试验，以对MT-sDNA的检测效能进行验证。

3 MT-sDNA的优势

基于上述研究，我们发现MT-sDNA对结直肠癌、进展期腺瘤及SSL等的检测具有一定的优势，主要体现为以下几个方面：

（1）敏感性高：如前文所述，多项临床研究表明，MT-sDNA对于结直肠癌及进展期腺瘤的检测敏感性均高于FIT及FOBT。特别是对于SSL，FIT和FOBT的诊断价值相对有限。但需要注意的是，MT-sDNA对于结直肠癌及癌前病变的检测敏感性在不同的研究和不同的受试对象间存在较大的差异，因此未来还需要开展囊括不同人群的大样本量的临床研究对其敏感性进一步验证。

（2）非侵入性、操作便捷：相比于结肠镜检查及FIT，MT-sDNA操作便捷，不需要进行肠道准备，结果也不受饮食影响，受试者在家中即可进行粪便样本留取，并通过快递的方式寄送至指定的检测实验室，检测结果可通过手机、电脑等设备查看。根据美国MT-sDNA筛查模式来看，受试者可通过电话、邮件等多种方式接受Exact Sciences公司提供的全天24小时指导及技术支持。美国的一项调查研究显示，美国适龄筛查人群接受MT-sDNA筛查的比例逐年上升，而结肠镜筛查比例则呈下降趋势，但总体的筛查率基本保持稳定[36]。我国人口基数大、结肠镜筛查资源相对紧张，美国的MT-sDNA筛查模式有一定的借鉴意义。

（3）提高结肠镜检查质量：有研究[37]将接受MT-sDNA筛查且结果呈阳性的患者分为盲组（在结肠镜检查前内镜医师不知晓患者MT-sDNA的检测结果）和非盲组（患者MT-sDNA的检测结果在结肠镜检查前告知内镜医师），结果显示非盲组患者的腺瘤及进展期腺瘤检出率分别为70%和28%，两项指标均高于盲组（分别为53%和21%）；另外，非盲组患者结肠镜检查的中位退镜时间（19 min）比盲组（13 min）长。这项研究表明，内镜医师对患者MT-sDNA筛查阳性结果的知晓提高了内镜医师的警惕性，从而有助于提高结肠镜检查的质量。

4 MT-sDNA的局限性

MT-sDNA是近年发展起来的结直肠癌筛查方法，在具有一定优势的同时，自身也存在着一定的局限性，主要体现在以下几个方面：

（1）成本效益低：Cologuard的生产、检测等各个环节需要由特定的实验室来完成，因此费用较高，美国非医保患者单次的检测费用超过500美元。近年来，有多项研究对包括MT-sDNA在内的多种结直肠癌筛查手段进行了临床获益与成本的模型评估[38-40]。根据ACS指南推荐的筛查方式，在同等获益的情况下，每3年一次的MT-sDNA所需要的费用高于每10年一次的结肠镜检查或每年一次的FIT检查。

（2）特异性偏低：根据前述的几项研究，相比于FIT，MT-sDNA对于结直肠癌及癌前病变的检测敏感性总体较高，而特异性偏低，假阳性率高，给部分受试者带来不必要的心理负担和经济损失，造成医疗资源的浪费。这个问题已经引起了广泛关注，为了提高Cologuard的特异性，研究者们一直在不断探索检测靶点的优化。

（3）MT-sDNA结果阳性后结肠镜检查依从性差：根据2020年发布的《中国结直肠癌筛查与早诊早治指南》[41]及Cologuard产品说明书的建议，MT-sDNA呈阳性的患者应尽早接受后续的结肠镜检查以进一步明确诊断。然而，美国的一项回顾性队列研究[42]表明，27%的MT-sDNA检测结果呈阳性的受试者没有进行后续的结肠镜检查，其主要原因是这些患者未得到充分的宣传教育，未能真正知悉该项检测结果呈阳性的指导意义。因此，在平均风险人群中推广以MT-sDNA为代表的结直肠癌无创筛查，重视检测前的宣教及检测后结果的解读对于提高MT-sDNA筛查结果阳性患者的结肠镜检查依从性显得尤为重要。

5 结语与展望

通过早期筛查可以有效预防结直肠癌，同时结直肠癌的预后也与早期诊断密切相关。早期结直肠癌大部分可以治愈，5年生存率可达90%。结肠镜检查是早期诊断结直肠癌的主要方式之一。近年来，随着色素内镜、放大内镜、窄带成像内镜、共聚焦激光内镜等多种内镜技术的进步与发展，内镜医师的诊断水平也不断提高。但是，结肠镜检查具有一定的局限性，包括相对侵入性、需要饮食准备和肠道准备、检查需要耗费的时间相对较长（通常是一整天）。加之我国人口众多，结肠镜筛查资源相对紧张，难以满足庞大适龄人群的筛查需求。

与结肠镜检查不同的是粪便DNA检测不具有侵入性，也无需进行饮食和肠道准备，具有无创、便捷的优势。MT-sDNA是对粪便标本中DNA突变位点和异常甲基化的联合检测，在结直肠癌的早期诊断中具有重要的临床意义。既往研究表明，相比于其他无创筛查方式，如FOBT以及FIT，MT-sDNA对结直肠癌、进展期腺瘤以及锯齿状病变等均具有较高的检测敏感性[26-27,29-30]。自2014年Cologuard被美国FDA批准纳入医保后，其检测量从2015年的10万多例增长至2019年的170万例，已成为美国结直肠癌筛查的主要手段之一。我国国家癌症中心于2021年发布的《中国结直肠癌筛查与早诊早治指南》也推荐MT-sDNA联合FIT检测作为结直肠癌早期筛查的重要手段之一[41]。但由于目前MT-sDNA尚未纳入我国医保支付范畴，我国MT-sDNA费用相对较高，单次为1 000～2 000元不等，高于结肠镜检查费用，这在一定程度上也限制了其推广与普及。未来，随着检测技术的逐步成熟和完善，检测成本的不断降低以及医保覆盖范围的不断扩大，MT-sDNA有望在我国适龄筛查人群中得以进一步推广，成为结直肠癌筛查的主要手段之一，助力提升我国结直肠癌防治水平。

利益冲突声明 全体作者均声明不存在与本文相关的利益冲突。