红树莓活性成分提取物的应用研究进展

赵小曼，李 晔，辛秀兰，陈 亮，于 然，吴志明

（北京电子科技职业学院生物工程学院，北京 100176）

红树莓起源于欧洲，经历了从野生浆果到被驯化传播的人工种植，目前在世界范围内广泛种植，是一种具有重要商业应用价值的水果，素有“黄金水果”之称[1]。红树莓最先在我国东北地区种植，目前在全国大部分地区均有栽培，种植面积高达1.0×104hm2，种植品种主要有宝石红、秋福、海尔特兹、菲尔杜德、欧洲红、澳洲红等[2-3]。红树莓是蔷薇科悬钩子属的多年生落叶灌木植物，成熟果实呈深红色圆球形浆果状，中心呈孔状，色泽光鲜、汁液浓郁[4]。干燥果实可作中药治疗用途，也称为覆盆子，具有味甘性平、益肾固精、补肝明目、可安五脏、悦泽肌肤（药典）等作用。红树莓因富含糖类、蛋白质、维生素、氨基酸、矿物质等[2，5]多种营养成分常以生食或加工的方式广泛应用在食品行业，同时其提取物中含有的花色苷、没食子酸、鞣花酸、树莓酮、SOD酶等[2]活性成分，已被证明具有抑制和清除自由基、抗炎抗菌抗氧化、提高免疫力、保护心脏和肝脏等功效[6-7]，因此在医药保健、化妆护理等领域的应用也在快速发展。

1 红树莓的活性成分及鉴定检测技术

1.1 活性成分

红树莓的果实、果籽、根茎和叶片中均有一定含量的活性成分，目前研究和应用主要集中在果实和果籽2个部位。主要活性成分包含脂肪酸、有机酸（含酚酸）、鞣花酸、黄酮、原花青素和超氧化物歧化酶SOD等。不同部位活性成分的具体组成和含量均有差异，因此在应用研究的相关领域也有所不同。红树莓果实是目前应用最为广泛的植物部位，可以鲜食，也可用作果汁、果酒、酸奶、果冻等加工食品。红树莓果籽是红树莓加工应用的主要副产物，长期以来都被当作燃料肥料甚至废弃物进行处理，造成了资源的极大浪费。实际上，红树莓籽在果实中的占比达到了9%~12%，采收率也很高[5]，Gonzaleze A等人[8]研究发现了红树莓籽中也含有丰富的营养物质和多酚类活性成分，应进行深入研究和开发利用，因此近几年红树莓果籽逐渐引起了研究者的重视，成为天然活性成分及应用研究的热门领域。红树莓的叶片和根茎也同样含有如鞣花酸等酚酸和芦丁等类黄酮之类的多种活性成分[9]，Teleszko M等人[10]通过对叶片的研究发现，所含多酚类物质甚至要显著高于果实，具有更好的抗氧化能力。

1.2 酸类活性成分的检测鉴定

红树莓中常见的酸类活性成分包括脂肪酸、有机酸等。脂肪酸主要存在于红树莓的籽油中，迟超等人[3]用GC/MS对于5个不同品种的红树莓籽油进行脂肪酸成分分析，测得不饱和脂肪酸占总脂肪酸的90.87%~93.33%。Sucurovic A等人[11]通过GC/FID的方法测定籽油中的脂肪酸组成，发现其具有高含量的多不饱和脂肪酸（PUFA），具体含量占比为：油酸16.92%，亚油酸54.95%和亚麻酸23.97%，这使得红树莓籽油可以成为一种较好的营养素。

红树莓中有机酸的组成较丰富，通常采用GB 5009.157—2016中提出的高效液相色谱法检测红树莓中的有机酸含量。旷慧等人[12]建立了一种用RP-HPLC来分离和测定红树莓果中5种类型有机酸的方法，测得不同品种的果实中有机酸以柠檬酸为主，含量为1.06~1.83 g/100 g，并含有一定量的草酸、乳酸和DL-苹果酸。红树莓叶片中的有机酸主要有绿原酸、没食子酸等，没食子酸的二聚衍生物鞣花酸也是目前应用研究工作的热点。鞣花酸主要以鞣花单宁等缩合形式存在。王金玲等人[13]用反相高效液相色谱测定了红树莓的鞣花酸含量，果实中游离形式的鞣花酸含量比较低，但通过酸水解得到的总鞣花酸含量最高可达155.98 mg/100 g。李峻[14]研究了不同品种和产地的红树莓叶片和枝条中的总鞣花酸和游离鞣花酸含量，发现叶片和枝条中的鞣花酸含量也很丰富，可以进行合理的加工利用，数据同时显示活性成分的组成和含量会受到品种、种植地区的气候条件、种植栽培技术等因素的影响。

1.3 树莓酮与黄酮类活性成分的检测鉴定

树莓酮[4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone），RK]是一种广泛应用的具有树莓特征气味的食用香精，还具有分解转化脂肪的功能，素有“天然脂肪转化因子”之称。树莓酮含量的测定常用色谱法，马永强等人[15]采用气相色谱法测定树莓酮的含量为2.803μg/g。旷慧等人[16]建立了高效液相色谱法测定树莓酮含量的方法，测得平均含量为3.32μg/g。旷慧等人[17]建立了HPLC-MS/MS测定树莓酮含量的分析方法，定量检出限可达1.0μg/kg。王金玲等人[18]建立一种有效、灵敏的UHPLC-MS/MS方法，采用分数因子设计优化电喷雾电离性能，优化了MRM跃迁，使定量限低至2 ng/mL。

黄酮类活性成分是一类以2-苯基色原酮为结构母核的化合物，包含有黄酮类、二氢黄酮类（如橙皮素）、黄酮醇类（如槲皮素、芦丁）、黄烷-3-醇类（如儿茶素，花青素类等）、黄酮类活性成分广泛存在于红树莓的果实、叶片和果籽中，一般使用可见分光光度计法，以芦丁为标准品，硝酸铝比色法测定总黄酮含量[10]。阴芳冉等人[19]采用高效液相色谱法进行分析，并对比研究了茉莉酸甲酯（MJ） 对果实中黄酮类活性成分的含量影响，在0.1 mmol/L的MJ作用下槲皮素含量可增高1.5倍，达到163.15μg/g。贾仕杰等人[9]采用UPLC-MS/MS法在红树莓叶中检出了包含芦丁、儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷在内的7中类黄酮活性成分。

1.4 花青素与原花青素的检测鉴定

花青素是红树莓独特多酚谱的主要特征，通过糖苷键与糖分子结合形成的花色苷形式存在于红树莓果实中，具有清除自由基的作用，从而保护细胞和机体免受氧化[20]，花青素是天然水溶性颜料的广泛来源，近年来花色苷作为食品着色剂和膳食抗氧化剂的潜在用途不断增长[21]。花青素一般采用pH值示差法测定总含量[22]，红树莓中的花色苷丰富，每100 g新鲜红树莓中总花色苷的含量为10~60 mg[21]。尽管所有浆果均包含基于花青素的花青素，但其并非均具有相似的糖苷单元。槐糖苷单元是红树莓中独特的花色素苷[23]。孙侨治等人[24]用高效液相色谱-质谱联用分析法鉴定出“秋福”红树莓果实中主要花色苷有花青素-3-槐糖苷，花青素-3-桑布双糖苷，花青素-3-葡萄糖苷，花青素-3-芸香糖苷，花葵素-3-葡萄糖苷和花葵素-3-芸香糖苷6种，其中花青素-3-葡萄糖苷含量最高，为1.29 mg/g。Ludwig I A等人[6]用HPLC-MS配合PDA检测器鉴定树莓果实中花青素-3-槐糖苷含量最高，花青素-3-葡萄糖苷次之。说明树莓品种、栽培条件及产地等会影响活性成分的含量差异。

原花青素类似于一种前花青素，可以在热酸处理下产生花色素的多酚类化合物，是目前国际上公认的可以有效清除人体内自由基的天然抗氧化剂。原花青素是由黄烷-3-醇单体缩合成的聚多酚类物质，聚合度为2~4为低聚体，聚合度高于4的为高聚体[25]。原花青素含量测定一般采用香草醛-盐酸法，高效液相色谱法可以分离测定不同聚合度的原花青素。研究发现，低聚原花青素可以抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，达到缓解餐后血糖升高的目的[26]，因此降解高聚原花青素也是目前研究的重点内容，芦宇等人[27]采用碱降解工艺，并用Box-behnken设计优化，使得原花青素的平均聚合度从5.44降到了2.14±0.11。

2 红树莓活性成分提取与纯化工艺

2.1 花青素与原花青素的提取纯化

总花青素通常采用酸化的甲醇、乙醇、丙酮、水或混合溶剂进行萃取，但常规的萃取费时且效率低下，且由于花青素稳定性受温度影响较大，长时间的热提取可能使其降解并降低其抗氧化的活性，因此研究者开发了微波辅助提取（MAE） 和超声波萃取（UAE）[21]。Wan S等人[28]曾采用UAE法对材料的工艺参数进行优化，包括超声功率、提取时间和温度，最终得到的总花色苷含量为0.163 mg/g。Teng H等人[29]曾利用MAE方法优化工艺，并测试了不同的溶剂，最终花青素含量为17.93 mg/100 g。Ying Liu等人[7]采用Box-behnken中心组合试验设计优化对比了2种方法，MAE（最佳条件为微波功率520 W，微波时间52 s，物溶剂比1∶35） 最终提取率比UAE（最佳条件为超声时间14 min，超声温度35℃，料液比1∶40）的最终提取率高约1.5倍，MAE提取物的抗氧化能力也高于UAE提取物。毕凯媛等人[30]利用超声辅助果胶酶法来提取花青素，提取含量较超声法提高了46%，且通过响应面优化方法得到最佳提取条件为果胶酶质量浓度5 mg/g，料液比1∶15（g∶mL），酶解pH值3，酶解温度50℃，酶解时间60 min，超声时间20 min和超声功率450 W。此外，采用压缩流体作为萃取剂的技术[21]也被应用于花青素的提取中，如亚临界水萃取（SWE），超临界流体萃取（SFE），加压流体萃取（PFE） 和加速溶剂萃取（ASE），这类方法具有更加环保的优势，但同时由于高成本难以应用于工业生产。通过以上方法提取的花青素纯度较低，常采用大孔吸附树脂进行纯化，Yu Yang等人[21]通过对比研究9种广泛应用的大孔树脂，发现AB-8型树脂对花青素的吸附和解析表现最好，经AB-8型树脂循环处理，花青素纯度提高19.1倍，回收率为98.84%。对于不同类型花色苷的分离，由于是离子型化合物极性较大且不稳定，传统的分离方法难以实现，朱丽君[31]建立了一种超声提取法、大孔吸附树脂纯化法结合高速逆流色谱法来分离花色苷。原花青素也可以用与花青素相似的方法进行提取，纪秀凤等人[32]利用超声波-酶法辅助提取，并通过响应面法优化后得率可达16.42 mg/g。

2.2 树莓酮与黄酮类的提取纯化

树莓酮与黄酮类活性成分，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，难溶或不溶于水，但乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂容易对活性成分会造成含量的损失[33]，因此甲醇和乙醇是最常采用的提取溶剂。宁玮钰等人[34]以不同体积分数乙醇作为提取溶剂进行对比分析发现50%乙醇提取总黄酮的含量最高。在此基础上还经常采用酶法、超声波法等进行联合辅助提取。李萌萌等人[35]采用0.01 mg/mL的纤维素酶辅助60%乙醇提取红树莓籽黄酮，在提取温度55℃，pH值5.5，提取时间40 min，料液比1∶40（g∶mL） 的条件下溶出量最大。采用300 MPa超高压辅助70%乙醇提取籽黄酮[36]，料液比1∶30，保压5 min籽黄酮得率最高可得55.4 mg/g，是纤维素酶的1.8倍，但此方法对设备要求较高。芦宇等人[37]采用超声波-纤维素酶联合辅提：纤维素酶添加量0.009 mg/mL，超声功率70 W，乙醇体积分数60%，提取时间45 min，提取温度55℃，pH值5.5，红树莓籽黄酮提取量最大。马永强等人[38]采用超声波辅助乙醇提取树莓酮，响应面法优化料液比、乙醇体积分数、超声时间和温度条件为料液比1∶15（g∶mL），乙醇体积分数85%，超声时间50 min，超声温度40℃，树莓酮提取量可达最大。通过以上方法溶出提取后，成分含量依然较低，不能满足后续研究和应用的需求，需要采用大孔树脂或聚酰胺等进行纯化处理。采用AB-8型大孔树脂进行纯化[27]的最佳条件为上样量100 mL，pH值4.5，上样流速1.5 mL/min，以60%乙醇、150 mL、流速1.5 mL/min洗脱，红树莓籽黄酮纯度与纯化前相比提高了23.12%。芦鑫等人[39]采用膜分离结合聚酰胺层析分离对树莓汁中黄酮进行纯化，黄酮浓度从19.779±0.040μg/mL上升到93.828±0.384μg/mL，回收率为94.876%±0.731%。

2.3 酸类活性成分的提取工艺

脂肪酸主要存在于红树莓的籽油中，对于籽油的提取常采用酶法、超声提取法和索氏提取法等。王新明等人[40]响应面优化水酶法提取工艺：料液比1∶5.5（g∶mL），酶添加量1.9%，酶解时间3.9 h，pH值7.3，籽油提取得率最高。李晓静等人[41]采用Box-Behnken响应面法优化酸性、碱性复合酶的提取工艺参数，酸性复合酶提取最佳：胃蛋白酶0.76%，果胶酶1.51%，酸性纤维素酶1.07%，提油率为86.11%±0.09%；碱性复合酶最佳工艺：胰蛋白酶1.52%，碱性蛋白酶1.99%，α-淀粉酶2.52%，提油率88.75%±0.08%，碱性复合酶提油率略高于酸性复合酶。唐琳琳等人[42]以正己烷为提取溶剂，对比了索氏提取法、超声提取法、高剪切-超声提取法的提取效果，根据提取得率和抗氧化活性综合分析，高剪切-超声提取法的籽油品质好，活性成分含量高。姚静阳等人[43]对比了超声辅助乙醇提取（UAE-E）t、超声辅助石油醚提取（UAE-PE）、索氏石油醚提取（SE-PE）3种不同的提取方式，结果表明UAE-Et的提取率和提取物活性均为最佳。此外，还可以采用超临界CO2萃取籽精油[44]。

有机酸提取的主要研究热点在鞣花酸，常用提取溶剂有水[12]、丙酮、乙醇和甲醇[13]，并用超声或者热回流进行辅助提取。刘丽娜[45]采用Box-behnken响应面法优化超声辅助提取鞣花酸工艺，在70%丙酮与红树莓籽粉的料液比1∶14（g∶mL），提取时间30 min，提取温度70℃的条件下，红树莓籽中鞣花酸提取量最大。王佳慧等人[46]用无水乙醇作提取溶剂，超声辅提鞣花酸，响应面法优化得到最佳工艺为料液比1∶14.04（g∶mL），提取时间19.72 min，提取温度80.02℃。

3 红树莓活性成分的作用与应用

3.1 药理保护作用及机理

红树莓中的活性成分大多是基于其体外抗氧化性能而首先进行研究的。研究表明，这些化合物具有影响受体、转运蛋白、基因表达和其他细胞事件的细胞信号传导途径的能力，与降低包括癌症、心血管疾病、糖尿病和肥胖症在内的慢性疾病的风险有关，在保护人类健康中具有重要的作用[23]。

3.1.1 抗炎抗氧化

唐佳丽等人[47]研究证明，红树莓冻果提取物能起到对羟自由基和超氧阴离子的清除作用。红树莓中花青素和鞣花酸是起到抗炎抗氧化作用的主要成分，花青素酚环中存在的双键、羟基侧链甚至糖基化都有助于清除自由基[20]，有效防止自由基的侵袭，从而防止细胞损伤，是一种天然的抗氧化剂[48]。与基于化学方法获得的结果相比，氧化性溶血抑制（OxHLIA）分析获得的结果具有生物学相关性，这种基于细胞的测定方法适用于评估天然提取物的抗氧化活性。Vara A L等人[49]通过此法获得红树莓提取物的IC50是298±13μg/mL。红树莓提取物的抗氧化性还可以防止由猪脑细胞膜中存在的PUFA氧化导致的反应性物质（如丙二醛）的形成，也可以保护β-胡萝卜素等亲脂性颜料免受自由基的侵蚀，保留其特征性橙色。红树莓提取物可以通过激活Nrf2信号级联反应来防御UVB诱导的光损伤，同时抑制MAPK P38激酶，改变了细胞凋亡信号通路（包括caspase-3）和炎症级联反应（如c-jun），并减弱了uvb诱导的NF-κB和COX-2的激活，以减轻UVB诱导的皮肤炎症[50]。Ludwig I A等人[6]通过研究红树莓提取物在人体内的代谢产物发现，花青素和鞣花酸等产生的抗炎抗氧化类的生物活性可能是由尿石素等酚类代谢物而不是其母体结构介导的。Geoffrey Istas等人[51]通过UPLC-QTOF质谱法分析血浆和尿液中红树莓的代谢物，发现血流介导扩张（FMD） 的改善与血浆鞣花酸、尿石素A-3-葡萄糖醛酸和尿石素A-硫酸盐相关，表明食用可达到饮食量的红树莓可在24 h内显着改善内皮功能。膳食中加入红树莓可预防硫酸葡聚糖硫酸钠（DSS） 引起的炎症和结肠炎症状[52]，红树莓花色苷对衰老造成的胸腺和脾脏指数的下降也有一定的改善作用[53]。

3.1.2 降糖降血脂

Giuliana D Noratto等人[54]研究发现，摄入红树莓可保护肥胖的糖尿病（db/db） 小鼠免受与Ⅱ型糖尿病相关的氧化应激。这种保护作用可能与在血红细胞和肝脏中抵抗ROS的GPx抗氧化酶活性的诱导有关。有研究表明，食用红树莓可以改善饮食引起的肥胖症中的胰岛素抵抗和代谢功能障碍，这与高脂饮食引起的NLRP3炎性体的抑制作用有关[55]。徐丽萍等人[56]用红树莓多糖对高血脂症模型鼠进行灌胃试验，有效降低了血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白三项指标的水平，且高密度脂蛋白呈上升趋势，表明了红树莓提取物中多糖具有降血脂的生物活性。Lijun Tu等人[57]研究了摄入红树莓提取物（RRE） 对高脂饮食（HFD） 诱导的高脂血症小鼠的影响，发现RRE处理可以加速甘油三酸酯向脂肪酸的转化，下调Hmgcr和Cyp7a1的基因表达，从而抑制肝脏胆固醇的合成和转化受，而Ldlr基因被下调的同时限制了胆固醇的运输。Natalie E VandenAkker等人[58]的研究表明，富含红树莓的饮食通过降低循环血浆总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，减弱肝脏甘油三酯积累并促进肝脏中微粒体甘油三酯转运蛋白的表达和下调脂肪酸合成酶的表达，从而积极地调节脂质代谢，起到降低血脂的作用。由于植物提取物的毒副作用较低，因此相对于药物来说，以红树莓进行膳食干预是一种补充预防高血脂症的可行方法。

3.1.3 癌症预防与辅助治疗

通过MTT试验研究表明，红树莓能抑制食管癌EC-109细胞的增殖，当红树莓质量浓度超过100μg/mL时，EC-109细胞会加速固缩破碎至凋亡[47]。张浩鹏等人[59]研究发现，红树莓提取物（RRE）能够降低周期相关蛋白cyclinA及CDK2的表达，同时下调P-AKT（Ser473） 的表达，因此红树莓提取物可能以AKT信号通路为靶点使得SMMC-7721细胞发生S期阻滞，从而抑制肝癌细胞的增殖。在HepG2细胞和Huh7细胞中，RRE同样在S期抑制细胞增殖并诱导细胞周期停滞；研究还表明该作用部分是由于通过降低PTEN基因启动子的甲基化状态和（或） 抑制DNMT1的表达来上调PTEN[60]。Yu-Zhen Sun等人[61]对红树莓根茎水煎剂的研究表明，红树莓可能逆转由肿瘤抗原和CTX引起的T淋巴细胞免疫抑制和免疫功能障碍，并且在调节机体的免疫功能方面具有一定作用。Zhou L等人[62]从红树莓中分离出4对对映体苯基丙烷（1a/1b-4a/4b），包括3种新化合物（1a和2a/2b），研究表明3a可以通过增强过氧化氢处理的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的过氧化氢酶（CAT） 的活性来选择性抑制凋亡诱导和活性氧（ROS） 的积累。

3.2 食品开发及工艺优化

红树莓提取物的生物活性和药理功效具有良好的膳食保护作用，在食品开发中能有效增加新食品的营养价值和安全值，使得近些年来红树莓类食品的研发也成为市场和研究热点。红树莓果汁是最直接最常见的果实提取物加工产品，天然果汁的高品质贮存需要采用有效的杀菌方式，李梦丽等人[63]对比分析了巴氏杀菌、煮沸杀菌和微波杀菌3种方式处理前后营养成分和理化性质的变化，巴氏杀菌能够更好地保持红树莓果汁的营养品质。对红树莓果实进行发酵处理可以制备果酒、果醋等产品。王宇添[64]采用果胶酶低温酶解将出汁率提高了10%，采用酿酒酵母VP5接种10%，发酵温度22℃；发酵后采用树脂降酸，硅藻土、明胶进行复合澄清，得到的果酒色泽清亮、酒香浓郁。夏天奇等人[65]采用皂土澄清红树莓果酒，添加皂土0.04 g/L，温度21℃，8 d后可将透光率提升到96.4%。吕长鑫等人[66]采用壳聚糖与皂土复合澄清，温度47℃，时间57 min，复合澄清剂配比9∶5，所得平均透光率为92.36%。将发酵菌种改为醋酸菌可以获得红树莓营养果醋[67]。栾生超等人[68]研究发现红树莓与乳酸菌相互作用时，可以补充碳源，促进乳酸菌（长双歧杆菌1.218 6） 的生长，而采用乳酸菌发酵的红树莓提取物抗氧化能力也得到提升。

在红树莓单一加工的基础上，研究者还将其与其他食品综合加工，彦廷才等人[69]研究了红树莓果冻的加工工艺。杨婧娀[70]将红树莓原汁加入到啤酒酿造中制备出红树莓精酿啤酒。张珍珍[71]将红树莓果实20%与赤霞珠葡萄80%混合发酵制备了红树莓葡萄酒饮品。黄旭华[72]制备了一种富含多酚的红树莓营养酱油。除此之外，研究者还开发了红树莓的固形物产品，如红树莓果冻[73]、果酱[74]和红树莓生姜红枣凝胶糖果[75]等。

4 结语

红树莓虽起源于欧洲，但在我国东北地区开始培植以来，随着红树莓栽培研究的不断深入，种植面积不断扩大，相关研究成果水平也在不断提高。红树莓中活性成分的研究应用由来已久，主要集中在果实中有效成分的利用和在食品开发中的应用，对于常见的根茎、树叶和果籽中活性成分的研究还不充分。红树莓的药用作用和对人体慢性疾病的防治效果是目前研究的重点，但是具体成分的药理保护作用机制还不十分明确，这也是红树莓后续研究的重要内容和持续性热点，与此同时，具有药理保护作用的红树莓活性成分以怎样便捷有效的方式供人体摄入也是值得思考的重点。