鼠巨细胞病毒升高血压并引起NLRP3炎症小体激活

石运忠，周维，王永佳，唐娜，席冬梅，王腊梅，钟华，何芳

(石河子大学医学院，新疆 石河子 832000)

作为一种常见的多发病，高血压是引起心功能衰竭、肾功能衰竭等心血管并发症的重要病因，其中大约95%的高血压为原发性高血压(Essential hypertension，EH)。随着对高血压研究的不断深入，人们发现其致病因素不仅与遗传和环境因素互作有关，还与人巨细胞病毒 (Human cytomegalovirus,HCMV)感染及炎症小体活化等机制有一定的相关性。有趣的是，内皮功能障碍和炎症反应是EH发生和发展的两个重要机制，这可能也是HCMV感染导致EH发生的原因之一[1-2]。

研究表明[3-5]，炎症小体的激活在心血管疾病如高血压的进展中起着核心作用，其中NLRP3(NOD-like receptors pyrin domain containing 3，NLRP3)等炎症小体活化与EH的发生发展密切相关。此外，Li等[6]在主动脉狭窄术(TAC)诱导的高血压模型中也发现：TAC组中NLRP3炎症小体及其下游效应子的表达显着增加，并伴随着心脏功能受损，而NLRP3炎症小体的抑制物雷公藤内酯醇可减弱TAC小鼠的心肌重塑并改善其心脏功能；不仅如此，吡非尼酮也可以通过抑制NLRP3炎性小体装配并调节ROS依赖性和ROS非依赖性途径中的NLRP3-IL-1β信号传导途径，改善小鼠模型中TAC诱导的左心室肥大和心肌纤维化[7]。以上研究均提示：NLRP3炎症小体的活化与高血压的发生发展密切相关。

值得注意的是，NLRP3炎症小体是由NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck qike protein containing-a-CARD，ASC)及效应蛋白酶解活化半胱氨酸蛋白水解酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)组成一种多蛋白复合物，其中NLRP3是组成NLRP3炎症小体的核心蛋白，它能够识别病原相关分子模式或危险相关分子模式并与其结合，进而达到活化NLRP3的作用[8]；ASC是凋亡相关斑点样蛋白基因编码的由195个氨基酸残基组成的衔接蛋白，主要发挥招募Caspase-1到炎症小体的作用[9]；Caspase-1是主要的效应分子，通过自身酶解催化形成具有生物活性的Caspase-1，最终介导IL-1β等细胞因子的成熟并参与炎症反应[10]。在本研究中，我们采用鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus，MCMV)腹腔感染C57BL/6 J小鼠建立高血压模型，通过检测炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18的表达量，探讨MCMV感染引起的高血压与炎症小体的活化关系，从炎症小体的角度部分阐明MCMV在原发性高血压中的作用和机制，并为临床高血压的预防与治疗提供新的思路与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物：7月龄雄性C57BL/6 J小鼠购自北京维通利华公司。

主要材料：NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、CARD凋亡相关微粒蛋白 (ASC)、半胱氨酸天冬蛋白酶-1 (Caspase-1)、白介素-18 (IL-18)、白介素-1β (IL-1β)等抗体购自美国Abcam公司；小鼠巨细胞病毒抗体IgM/IgG酶联免疫分析试剂盒购于武汉酶免生物科技有限公司；柠檬酸抗原修复缓冲液、过氧化氢溶液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

主要仪器：OLYMPUS TH4-200倒置显微镜(SANYO公司，日本)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟，中国)；凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)；BIO-RAD68O酶标仪(BIO-RAD公司，美国)。

1.2 构建并鉴定MCMV感染小鼠疾病模型

将7月龄大的雄性C57BL/6 J小鼠随机分为MCMV组(n=10)和对照组(n=10)。MCMV组每周一次腹腔注射鼠巨细胞病毒悬液(105pfu·mL-1,1 mL)，对照组腹腔注射1 mL生理盐水；持续干预至12月龄后，采用双抗体夹心法检测小鼠血清中MCMV IgM/IgG浓度，操作步骤按照巨细胞病毒抗体IgM/IgG酶联免疫分析试剂盒(武汉酶免生物科技有限公司，中国)说明书操作。酶标仪450 nm波长下测定吸光度(OD值)，最后通过标准曲线计算样品中MCMV IgM/IgG浓度。

1.3 血压监测

使用腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)成功麻醉小鼠后，颈部备皮并沿颈正中线切开，分离肌肉及暴露血管，游离左侧颈总动脉并结扎远心端，使用动脉夹暂时阻断颈总动脉血流，留置针穿刺颈总动脉并固定，连接BL-420F生物机能实验系统进行血压监测(每组5只)。监测各组小鼠颈动脉收缩压(Systolic blood pressure,SBP)、舒张压(Diastolic blood pressure,DBP)，并计算平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP) (MAP=DBP+1/3(SBP-DBP))。

1.4 Western Blot

液氮上研磨主动脉血管组织至匀浆状态并提取组织总蛋白。抗体选用炎症小体相关蛋白NLRP3(1∶20 000,Abcam美国)，ASC(1∶250,Abcam美国)，Caspase-1(1∶1 000,Abcam美国)，IL-1β(1∶800,Abcam美国)，IL-18(1∶800,Abcam美国)，pro-Caspase-1(1∶1 000,Abcam美国)，pro-IL-1β(1∶800,Abcam美国)；内参选用β-actin(1∶1 000,Boster中国)。使用Image J软件对Western Blot印迹条带进行定量。

1.5 免疫组织化学

主动脉血管组织石蜡切片采用高压法进行抗原修复，本研究使用的抗体分别为NLRP3 (1∶100,Abcam美国)、ASC (1∶100,Abcam美国)和Caspase-1 (1∶25,Abcam美国)。使用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件，每组随机选取5个视野的积分光密度值进行测定 (Integral optical density，IOD)。

1.6 统计分析

统计方法选用独立样本t检验，统计分析软件选用SPSS 20.0进行数据分析，数据采用平均值±标准差表示.P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 MCMV成功感染C57BL/6 J小鼠

我们在MCMV感染小鼠5月(12月龄)后,采用酶联免疫吸附实验检测了小鼠血浆中MCMV IgG/IgM抗体浓度。与对照组相比，MCMV感染组小鼠IgG、IgM浓度值显著升高 (P<0.05) (表1，图1)，表明MCMV感染C57BL/6 J小鼠建模成功。

表1各组小鼠MCMV抗体浓度比较

分组MCMV IgGMCMV IgM对照组12.79±1.1516.42±1.39MCMV组46.07±3.59∗35.30±2.66∗F2.5173.015P0.0030.007

图1 ELISA法检测小鼠血浆中MCMV IgM/IgG浓度

2.2 MCMV感染引起C57BL/6 J小鼠血压升高

接下来，我们使用有创血压监测小鼠主动脉血压水平，结果显示：MCMV组与同月龄对照组相比，MCMV干预5月(12月龄)后，MCMV组小鼠收缩动脉压(SBP)、舒张动脉压(DBP)和平均动脉压(MAP)均均显著升高(P<0.05)(表2,表3，图2)。

表2各组小鼠7月龄血压(SBP、DBP、MBP)比较

分组SBPDBPMBP对照组122.06±3.08112.73±2.63115.43±1.38MCMV组123.48±4.26111.51±0.79114.02±2.41F1.2142.3232.644P0.9810.8441.254

表3各组小鼠12月龄血压(SBP、DBP、MBP)比较

分组SBPDBPMBP对照组136.06±4.08123.73±4.63127.34±3.38MCMV组151.48±6.26∗134.70±3.97∗142.02±3.47∗F2.1833.4222.971P0.0370.0080.016

t检验，MCMV组与同月龄对照组相比，*表示P<0.05 差异有统计学意义。图2 MCMV感染对小鼠颈动脉血压的影响

2.3 MCMV感染对主动脉组织NLRP3炎症小体蛋白的影响

为探究MCMV感染小鼠后，我们使用Western Blot与免疫组织化学法检测了小鼠主动脉中炎症小体等基因表达水平，结果显示：与对照组相比，MCMV组主动脉组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β等蛋白表达显著增加(P<0.05)，Caspase-1、IL-1β蛋白活化程度增加(P<0.05)，IL-18蛋白变化不明显(P>0.05)(图3)；以上结果表明MCMV感染可使炎症小体相关蛋白表达增加，提示MCMV感染引起高血压的发生，其机制可能与炎症小体活化相关。

t检验，MCMV组与同月龄对照组相比，*表示P<0.05差异有统计学意义。图3 MCMV感染对小鼠主动脉组织炎症小体相关蛋白的影响

2.4 MCMV感染对血浆NLRP3炎症小体活化蛋白的影响

我们使用酶联免疫吸附实验观察了小鼠血浆中IL-1β与IL-18的表达水平。结果显示：与对照组相比，MCMV感染组小鼠血浆中IL-1β表达水平显著升高(P<0.05)，而IL-18表达水平无显著变化(P>0.05)(表4，图4)。

表4各组小鼠血浆中IL-1β、IL-18浓度测定

分组IL-1βIL-18对照组42.69±4.2863.27±5.88MCMV组62.16±4.84∗72.93±8.78F3.2414.932P0.0360.47

t检验，MCMV组与同月龄对照组相比，*表示P<0.05差异 有统计学意义。图4 MCMV感染对小鼠血浆中IL-1β、IL-18浓度的影响

3 讨论

人巨细胞病毒(HCMV)是疱疹病毒家族的成员，并且HCMV感染被列为成人中最常见的感染之一，全球血清阳性率在60%至99%之间。一旦感染将终生携带，并且可能会重新激活形成裂解性感染。Firth 等[11]通过 ELISA 方法检测1091名70岁以上老人HCMV感染情况，结果显示：在所有受试者当中，65%的受试者存在HCMV感染，HCMV阳性组受试者的收缩压高于阴性组；采用多元线性回归分析，调整与收缩压显著相关的性别、年龄、高血脂、高血糖等其他因素的影响，HCMV 感染情况仍与收缩压呈正相关；同时课题组前期的研究[12]发现HCMV是促进原发性高血压发生发展的重要因素之一，由于巨细胞病毒具有严格的种属特异性，无法建立HCMV的动物疾病模型，因此通常利用小鼠MCMV 感染小鼠模型进行整体研究。虽然有文献[13]指出：MCMV感染导致体内血压显着升高，其机制与炎症反应、氧化应激、RAAS激活、内皮功能障碍相关。但到目前为止，高血压的病因和发病机制仍未明确。

在本研究中，我们的模型选取了7月龄C57BL/6 J小鼠，接近中老年[14]，通过 MCMV感染7月龄C57BL/6 J小鼠，成功构建高血压疾病模型。在MCMV感染小鼠的过程中，CMV-IgM在CMV感染宿主后3～5 d产生，仅持续12～16周。因此，CMV-IgM可作为评价CMV近期感染的指标。CMV-IgG是唯一可以通过的胎盘的抗体，在CMV感染宿主后7～14 d出现，到第4～8周达到峰值，因此可作为既往感染的指标。本研究由于MCMV为连续性腹腔感染干预，故小鼠IgM、IgG抗体浓度均呈升高趋势。因此通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测表明MCMV已成功感染小鼠。通过颈动脉测压法检测小鼠血压，结果显示：与对照组相比，MCMV腹腔注射至12月龄时，MCMV组小鼠SBP、DBP和MAP均较对照组明显升高，表明MCMV感染可引起小鼠血压的升高，这与Shi[13]的研究一致。

NLRP3炎症小体可被多种信号激活触发炎症反应并促进原发性高血压的发生[15]，NLRP3炎症小体的组装和激活与多种心血管疾病危险因素(例如高血压和糖尿病)的发病机理有关。目前已有研究[16]表明：在小鼠内耳中，MCMV感染可增加ROS的水平并激活NLRP3炎症小体；同时，Li等[17]人发现在MCMV诱导的小鼠肺纤维化中，NLRP1和NLRP3炎症小体蛋白表达被上调。

众所周知，炎症小体通过Caspase-1调节pro-IL-1β和IL-18的加工、成熟[18]，而IL-1β和IL-18是IL-1细胞因子超家族的成员[19]，IL-1家族细胞因子被认为是“早期反应”细胞因子，它们在免疫反应的最早阶段被释放，并作为随后的促炎性细胞因子级联的触发因素[3]。IL-1β刺激IL-6和IL-17a的释放，而IL-18促进IFN-γ、IL-2和IL-12的产生，这些下游细胞因子与T-helper 1(Th1)和T-helper 17(Th17)型免疫反应有关，并且有证据表明Th1和Th17细胞在高血压中起主要作用[20-21]，因此，有文献[22-23]指出高血压中IL-1β和IL-18水平可以作为间接证据表明高血压与炎症小体的激活有关；在本研究中，我们发现MCMV组主动脉组织NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达增加，表明MCMV感染促进高血压的发生，其机制可能与MCMV激活NLRP3炎症小体有关。但在我们的研究中，并未发现MCMV感染对主动脉组织蛋白IL-18的表达有显著影响，其可能的原因是NLRP3炎症小体对IL-18和IL-1β的成熟加工具有不同的调节[24]；同时Pirhonen等[25]在针对甲型流感病毒及仙台病毒的研究中发现，由于单核细胞和巨噬细胞对病毒感染的敏感性不同，因此它们产生IL-1β和IL-18的能力不同，这也可以部分解释我们的研究结果。

尽管如此，我们的研究仍存在局限性，目前仅从动物整体水平提示MCMV对血压调节的可能途径，并未从整体动物模型和细胞实验水平验证抑制NLRP3炎症小体活化可否逆转MCMV感染对血压的升高，其具体调节过程还需后期深入研究来以进一步证实明确本研究中涉及的作用机制。鉴于MCMV与高血压密切相关，我们的发现为阐明MCMV与原发性高血压之间关系的作用机制提供了新的思路与依据。总之，本研究表明，MCMV感染引起的高血压与NLRP3炎症小体激活有关，通过干预NLRP3炎症小体活化有望成为MCMV感染诱发高血压防治的新靶点。