三个楸树优良无性系的组培快繁技术研究

胡 倩，赵天宇，张新叶，耿若楠，洪聪慧，刘 同，杜克兵*

(1.华中农业大学 园艺林学学院，武汉 430070；2.湖北省林业信息技术研究中心(华中农业大学)，武汉 430070；3.襄阳市林业科学研究所，湖北 襄阳 441052；4.湖北省林业科学研究院，武汉 430075)

楸树(Catalpabungei)是紫葳科(Bignoniaceae)梓树属(Catalpa)的高大落叶乔木，常作为优质的用材树种，也是著名的园林观赏树种，已有2000余年的栽培历史[1-3].楸树树干高耸，树冠浓密，树姿优美，春季嫁接苗当年可高达3～4 m，成年楸树可高达30 m，不仅观赏效果极佳，且其木材质地适中、坚韧致密、耐腐蚀、耐潮湿，在各种行业中被广泛应用[4-5].此外，楸树还具有极高的药用价值，叶、树皮、种子均可做中药药材，综合利用价值极高[6].

由于楸树自花不孕，结实量极少，种子自身的发芽率也不高，所以通过实生繁殖较困难[7].目前，生产上多采用嫁接和扦插的方法生产种苗，但楸树扦插生根较困难，嫁接成本高，而且受季节限制，所以这些方法都无法满足短期内提供大量苗木的需求.采用组织培养的方法，不仅可以提高繁殖系数，而且速度快、成本低、不受季节环境的限制[8-10].目前，虽有一些关于楸树的组培快繁研究的报道，但不同品种的基因型不同，其内源激素的种类和浓度存在差异，组培过程中所需要的营养和外源激素用量也不完全相同，从而导致不同品种的离体快繁体系存在差异[11-13].因此，有必要针对特定优良品种建立相应的组培快繁体系.本研究以开花量大的楸树优良单株为试材，进行组织培养快繁研究，以期建立完整高效的离体快繁技术，为苗木的生产应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

楸树优良单株1#(简称DH1)、2#(简称DH2)和5#(简称DH5)，这3个优良单株均由襄阳市林业科学研究所从当地野生滇楸资源中筛选得到，具有开花量大的特点，可作为园林观赏材料.

1.2 基本培养基

在植物组织培养中，常使用MS、1/2MS、N6、DKW和WPM培养基，根据不同材料选用合适的培养基，一般来说，MS培养基含的营养元素适合大部分植物生长，DKW和WPM培养基适合一般木本植物生长，因此本试验选用MS、DKW、WPM三种常用的培养基作为基本培养基.在7-9月，晴天采集DH1、DH2和DH5的幼嫩带芽茎段，用少量洗洁精浸泡2 min，刷去表面灰尘，之后放入大烧杯中，用无纺纱布封口后，蒸馏水冲洗2 h；随后用100 mg/L PVP浸泡5 min，200 mg/L链霉素+400 mg/L青霉素液浸泡15 min，用蒸馏水再次清洗30 s.转入超净工作台中，用70%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗2次，30 s/次；再用0.1%氯化汞消毒6.5 min，无菌水冲洗5次，30 s/次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，切成1～2 cm的带芽茎段，分别接种到MS、DKW、WPM基本培养基中(不添加任何激素).培养20 d后统计外植体的污染率(P)与褐化率(B)，以筛选合适的基本培养基.P=(N1/N)×100，其中，P表示污染率，N1表示污染外植体数量，N表示接种时外植体总数.B=(N2/N)×100，B表示褐化率，N2表示褐化外植体数量，N表示接种时外植体总数.

1.3 培养条件

接种时，每个处理3次重复，每次重复5瓶，每瓶培养基接种2个外植体，即每种材料接种30个茎段.培养基均进行高压蒸汽灭菌(121 ℃，100 kPa)20 min.接种后，将材料置于(25±2)℃的组培室内培养，光照强度为1 500～2 000 lx，光照时间为16 h/d.

1.4 初代培养

通过预实验发现，当NAA浓度高于0.05 mg/L时，不利于腋芽萌发，且根据张烨然等[14]研究数据，将激素种类设置为6-BA(1.0、2.0 mg/L)、IBA(0、0.1、0.2 mg/L)、NAA(0、0.01、0.03 mg/L)，共8种培养基(IM1～IM8；表1)，以DKW为基本培养基，添加1.0 g/L活性炭+0.8%琼脂+2.5%蔗糖，pH=5.8；用DH1、DH2和DH5幼嫩带芽茎段为试材，经初代消毒后接种于培养基中.接种30 d后统计腋芽萌发率(G)，以筛选合适的初代培养基.G=(N3/N)×100%,其中，G表示腋芽萌发率，N3表示萌芽外植体数量，N表示接种时外植体总数.

表1 初代培养基、增殖培养基和生根培养基中的激素设置

1.5 增殖培养

张烨然等[14]研究显示6-BA和IBA对楸树试材的增殖系数影响显著，本试验在其基础上依照张蕊等[15]对NAA梯度筛选的试验结论，进一步筛选不同浓度NAA与6-BA、IBA组合对其增殖系数的影响，因此将激素种类设置6-BA(0、2、3 mg/L)、IBA(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)、NAA(0、0.05、0.20 mg/L)，共11种培养基(PM1～PM11；表1)，以DKW为基本培养基，添加2.5%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；以初代培养中萌发的腋芽为试材，在腋芽高1～2 cm时，切下腋芽接种于增殖培养基中.培养35 d后统计增殖系数(M)，以筛选适宜的增殖培养基，M=(M1/M2)×100%.其中，M表示增殖系数，M1表示培养35 d时的有效芽数，高于1 cm的芽记为有效芽；M2表示接种时的总芽数.

1.6 生根培养

以DH1、DH2和DH5高于2 cm的试管苗为试材，接种于生根培养基中.以DKW为基本培养基，添加2.5%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；激素种类设置NAA(0、0.1、0.2 mg/L)、IBA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)，共7种培养基(RM1～RM7；表1)培养30 d后统计根系数量、根长和生根率(R)，以筛选适宜的生根培养基.R=(R1/R2)×100%，其中R表示生根率，R1表示培养30 d生根苗数，R2表示接种时总芽数.

1.7 数据分析

表格中的数据为平均值±标准误(n=3).所有试验数据采用SAS8.1统计软件进行方差分析(ANOVA)、多重比较(Duncan’s).百分数经过反正弦转换后再用于方差分析.

2 结果与分析

2.1 基本培养基筛选

DH1、DH2和DH5茎段接种20 d后的褐化率和污染率，以及接种30 d后的腋芽萌发率见表2.3种材料在MS与WPM培养基中的腋芽萌发率相对较低，幼芽弱小，大小不均一，部分叶片黄绿，且玻璃化幼芽比例较高，而在DKW培养基中腋芽萌发率相对较高，且幼芽生长健壮，大小均一，叶片深绿.DH1、DH2和DH5的表现基本一致，认为DKW更适合作为3种材料的基本培养基(表2).

表2 基本培养基筛选结果

2.2 初代培养效果

与DKW基本培养基相比，添加外源激素(6-BA、NAA、IBA)显著提高了外植体的腋芽萌发率.DH1、DH2和DH5在接种后6～8 d腋芽开始萌发.8种初代培养基中，DH1和DH2以IM5的腋芽萌发率最高，分别达到83.33%和86.67%，显著高于其余7种培养基(P<0.05；表3)；DH5与DH1、DH2有所不同，以IM6的腋芽萌发率最高，达到80.00%，但与IM5的腋芽萌发率(70.00%)差异不显著(P>0.05).因此，认为可选择IM5，即DKW+0.8%琼脂+1.0 g/L活性炭+2.5%蔗糖+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA作为3种材料的初代培养基，其萌发的幼芽生长健壮(图1).

表3 初代培养的腋芽萌发率

图1 DH1、DH2和DH5的初代培养

2.3 增殖培养效果

与不添加激素的PM1相比，外源激素(6-BA、NAA、IBA)显著提高了DH1、DH2和DH5的增殖系数(表4)，但3种材料之间的表现不完全一致.培养35 d时，DH1和DH2均以PM10的增殖系数为最高，分别达到6.53和6.70，为PM1的4.77倍和3.79倍，且幼苗健壮.DH5则以PM11的增殖系数为最高，达到5.73，为PM1的4.66倍，但与PM10的增殖系数(5.47)差异不显著(P>0.05).综合而言，认为PM10，即DKW+0.6%琼脂+2.5%蔗糖+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA较适宜3种材料的增殖培养(图2).

图2 DH1、DH2和DH5的增殖培养

表4 增殖培养的增殖系数

2.4 生根培养效果

与不添加激素的RM1相比，外源激素(NAA、IBA)显著促进了DH1、DH2和DH5的生根率、生根数量与长度(P<0.05；表5).接种30 d时，在RM1中，DH1、DH2和DH5的生根率分别为20%、6.67%和0，且根系数量少，长度短.在RM2～RM7中，三者的生根情况均优于RM1，但不同材料的表现不完全相同.DH1以RM5的生根效果最好，生根率最高(100%)，根系数量最多(9.37)，根长最长(4.96 cm).DH2在RM5中的生根率最高(100%)，根系数量最多(8.50)，而在RM6中根长最长(5.14 cm)，但与RM5(4.87 cm)中的根长差异不显著(P>0.05).对于DH5，在RM6中的生根效果最好，生根率最高(100%)，根系数量最多(7.70)，根长最长(4.83 cm).总体而言，DH1、DH2和DH5在RM5和RM6中均能够获得较好的生根效果，除DH1与DH2的生根数量在两种培养基之间存在显著差异外，其余指标的差异均不显著.因此，RM5和RM6均适宜3种材料的生根培养，即DKW+0.8%琼脂+2.5%蔗糖+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA或DKW+0.8%琼脂+2.5%蔗糖+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA(图3).

表5 生根培养试验结果

注：表中的数据为平均值±标准误(n=3)；位于同列中的不同字母表示差异显著(P<0.05).

图3 DH1、DH2和DH5的生根培养

3 结论与讨论

不同基本培养基所提供的营养成分有所不同，培养的效果亦不同，是决定组培成败的关键因素.目前，楸树中已报道的基本培养基主要包括1/2 MS、MS、WPM、DKW和N6[16-20].李小艳等[16]研究了N6、DKW和WPM 3种培养基对楸树初代腋芽萌发的影响，发现在N6培养基中，外植体萌芽较快，但20 d后开始出现顶芽变褐，继而坏死的现象；在DKW培养基中，腋芽分化较N6的慢，接种15 d后大部分叶片才开始生长，但25 d后叶片大而绿，茎粗壮，新叶生长旺盛；在WPM培养基中，腋芽分化最慢，诱导率最低，后期还易出现玻璃化现象.本研究中，DH1、DH2和DH5在DKW培养基中的腋芽萌发率明显高于MS和WPM培养基，且幼芽生长健壮，大小均一，叶片深绿，该结果与李小艳[16]的研究结果相似.因此，认为DKW更适合作为DH1、DH2和DH5的基本培养基.

从已报道的楸树初代培养结果来看，不同楸树种类或品种对培养基成分，尤其是激素种类与浓度的要求有所不同.例如，孟路等[13]发现朝霞楸(Catalpabungei‘Zhaoxia’)和云朵楸(Catalpabungei‘Yunduo’)的茎段在2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA上腋芽效果较好，萌发率达80%以上，而洛楸1号(Catalpabungei‘Luoqiu1’)和鲁楸1号(Catalpabungei‘Luqiu1’)的茎段在1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA上腋芽萌发较好，可达100%.张烨然[14]等发现6-BA+NAA组合并不能促进楸树(QS2)和滇楸(DQ72)的腋芽萌发，而6-BA+IBA有利于促进腋芽萌发，且1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA较适合初代培养.本研究发现，1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA较适宜DH1、DH2和DH5的初代培养，接种30 d后腋芽萌发率均达到80%左右，但不同无性系之间存在一定差异，这与孟路[13]和张烨然[15]的研究结果相似.

继代增殖培养是组培快繁的关键，其中增殖系数是衡量繁殖效率的重要指标，与外源激素的种类与浓度密切相关[17-19].目前报道的用于楸树增殖培养的激素主要包括IBA、NAA和6-BA等[20-21]，但不同楸树材料适宜的激素种类与浓度有所不同，增殖效果亦存在较大差异，这可能与材料的基因型以及幼嫩程度有关[22-23].例如，孟路等[13]发现在含0.1 mg/L IBA的培养基中，不同楸树品种增殖所需适宜的6-BA浓度有所不同，1.0 mg/L 6-BA最适宜洛楸1号增殖，增殖系数为4.70；1.5 mg/L 6-BA 最适宜云朵楸和鲁楸1号增殖，增殖系数分别为3.38和5.68；3.0 mg/L 6-BA最适宜朝霞楸增殖，增殖系数可达5.49.张蕊等[15]研究发现6-BA和NAA的交互作用对周楸20号增殖系数的影响不显著，而NAA和6-BA对其增殖系数的影响显著，两者浓度的比值与增殖系数有一定关系，当NAA为 0.15 ～ 0.20 mg/L，6-BA为0.8～1.6 mg/L时，增殖系数较高.在本研究中，3种材料对6-BA和IBA浓度的需求亦不完全相同.DH1和DH2以培养基中添加3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA时的增殖系数最高，分别达到6.53和6.70，而DH5则以添加3.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA时的增殖系数最高，为5.73.

生根培养是建立高效组培快繁体系的重要步骤，直接影响组培苗的生产应用效率.从已有文献来看，楸树组培苗生根并不十分困难，现已报道的楸树生根率大部分在70%～100%之间，生根数量介于2.0～20.0条，根长介于3～10 cm，但不同楸树种类或品种适宜的生根培养基成分并不完全相同[12-13，23].例如，孟路等[12]发现朝霞楸在WPM+0.1 mg/L NAA+0 g/L活性炭培养基上，生根率最高达97%，平均根系数量可达6.7条，根长最大达4.88 cm.聂琳等[23]在1/2 MS+0.5 mg/L NAA培养基上培养楸树幼芽，生根率可达100%，平均根数10条，平均根长4.00 cm.本研究发现，以DKW+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA或DKW+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培养DH1、DH2和DH5均可取得较好的生根效果，接种6～7 d即开始生根，30 d时三者的生根率均达到95%以上，生根数量介于7.13～9.37条，根长介于4.6～5.0 cm.