单细胞测序技术在动脉粥样硬化研究中的研究进展

王 莉，李晓辉综述，司春婴，关怀敏审校

0 引 言

目前我国心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段，心血管疾病的防治面临严峻形势[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病的主要病理基础，临床上常导致心肌梗死、脑梗死等严重心脑血管病[2]。随着高通量测序技术尤其是单细胞基因组测序技术的建立和发展，对疾病的认识和基因组特征的分析进入单细胞水平。单细胞测序技术能够揭示单个细胞的基因结构和表达状态，是研究细胞异质性的有力工具。本文就单细胞测序技术在AS中的应用进展作一综述。

1 单细胞测序技术简介

1.1 单细胞测序技术的发展单细胞测序技术是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序的新技术，是当前生物科研领域的焦点，其中应用最广泛的是单细胞转录组测序。在相似的细胞类型中，基因表达可能是异质的，常规转录组测序得到的是组织内基因的平均表达水平，掩盖了单个细胞之间存在的差异，而疾病的发生机制，却可能只与其中的某种细胞相关[3-4]。2009年，Tang等[5]首先报导应用了单细胞转录组测序方法，提出在样本材料有限的情况下，需要更灵敏的检测技术，单细胞测序应运而生。自2013年单细胞转录组制备系统Fluidigm C1面世以来，出现了多种检测技术平台，特别是2017年商业化的10×Genomics单细胞RNA测序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)技术出现，对于大量细胞的转录组定量更经济，系统稳定性更高，进一步降低了技术门槛，扩大了单细胞测序的应用范围[6-7]。单细胞测序技术在鉴定新的细胞类型，探索细胞动态发育过程，鉴定基因调控机制方面显示出巨大的优势，但早期因无法获取细胞空间分布信息限制了其进一步的应用。为弥补这一缺陷，2019年开发出基于测序的空间转录组技术——Slide-seq[8]，将RNA从组织样本转移到覆盖有已知位置的DNA条形码珠子的表面，从而允许通过测序确定RNA的空间位置，2020年改进后的Slide-seqV2使RNA捕获效率比上代显著提高，且具有高转录组映射的空间分辨率[9]，令Slide-seqV2成为实验中的利器。

1.2单细胞测序流程单细胞测序流程主要包括：单细胞获取、测序文库构建、单细胞核苷酸序列扩增和扩增产物测序。单细胞分离是制备单细胞测序样本的第一步，严格的细胞分离策略将有助于产生更加可靠的数据。对于组织的处理需要先消化解离成单细胞悬液，再进行清洗、过滤、计数和细胞活力评估，以用于后续的上机和文库制备。目前的单细胞检测平台中，通量较高的技术如荧光激活细胞分选可根据细胞的大小、形状或细胞表面标志物的表达进行有偏向的选择，而基于微液滴技术的10×Genomics Chromium以及较晚推出的基于微孔技术的BD Rhapsody平台可实现细胞的无偏向分离[10]。对于转录组测序而言，单细胞分离后的常见步骤包括单细胞裂解，逆转录为第一链互补DNA(complementary DNA，cDNA)，第二链合成和cDNA扩增。在平台中裂解分离出的单细胞释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的cDNA[11]。在逆转录的过程中，特殊分子标记(unique molecular identifier，UMI)的引入可在很大程度上纠正扩增造成的结果偏倚和降低背景噪音，可更精确地定量单细胞中mRNA分子的初始量[12]，之后，通过体外转录或聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增cDNA，将扩增好的cDNA用于高通量测序。

1.3数据处理与分析首先，需要对测序原始数据生成FASTQ reads格式进行质量控制，基于UMI总数和检测到的基因数等过滤掉不合格的数据，再转换成基因表达矩阵做基础信息分析。细胞亚群分类是单细胞测序数据分析的重点，将大量复杂的数据进行降维可视化普遍采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和t分布随机邻域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE)算法[13-14]。细胞分群后需结合软件及文献查询识别各个细胞类型的标记基因，对各个亚群细胞进行注释命名。基于R语言的Seurat单细胞软件分析包是目前应用最广泛的工具之一，可用于数据质控、细胞筛选、细胞类型鉴定、特征基因选择、差异表达分析、数据可视化等[15]。除鉴定细胞类型，得到的数据还可做细胞亚群分化拟时轨迹分析[16]、调控网络分析[17]、生物信息学分析等，深入挖掘细胞状态转换、细胞功能和相互作用机制。

2 单细胞测序技术在AS中的应用

2.1 单细胞测序技术与AS炎症免疫机制先天性和适应性免疫反应在致AS所有阶段均起着重要作用，包括AS形成、进展和斑块破裂等，导致动脉壁内膜增厚，管腔狭窄甚至闭塞[18-19]。单细胞测序技术应用于AS研究为免疫细胞功能在AS斑块的作用提供了新的见解。

2.1.1描绘AS免疫细胞图谱现在有大量的证据支持AS是一种动脉内膜脂质驱动的炎症性疾病，促炎和炎症缓解机制的平衡决定了最终的临床结果，但对于动脉免疫细胞的表型和转录多样性尚不清楚。Jennifer等[20]在载脂蛋白E缺乏症ApoE(-/-)小鼠构建的AS动物模型中，用scRNA-seq和质谱流式细胞技术研究AS中的髓样细胞亚群，在主动脉CD45+细胞中聚类确定了包括单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等在内的13个免疫细胞种群，揭示了高脂饮食会使AS形成过程中的细胞群偏向于炎性单核巨噬细胞群，而不是固有巨噬细胞和经典2型树突细胞(classic type 2 dendritic cells，cDC2)，描绘了血管内AS的免疫细胞组成和转化趋势。Winkels等[21]通过scRNA-seq和流式细胞技术对健康小鼠和AS小鼠主动脉的免疫细胞进行深度表征，检测到主要由巨噬细胞、T细胞和单核细胞组成的11个细胞集群，具有独特的表型和空间特征，而健康主动脉的细胞多样性较少，基因富集分析表明，脂质代谢、增殖和炎症细胞因子分泌等多种途径仅限于特定的白细胞集群，揭示了AS新的免疫机制，建立了AS白细胞的功能相关性。

2.1.2T淋巴细胞CD4+T细胞常见于AS斑块，1型辅助性T细胞(type 1 helper T cells，TH1)具有促AS作用而调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)具有抗AS作用[22]。通过大规模细胞计数和scRNA-seq进行细胞免疫表型分析已经发现了一些出乎意料的T细胞多样性。Butcher等[23]首次将scRNA-seq应用于AS领域，通过应用Fluidigm C1单细胞测序系统进行scRNA-seq和PCR，在AS小鼠中鉴定出此前从未检测出的干扰素γ(+)Th1/Treg细胞亚群，该细胞亚群存在Treg和Th1共同表达的基因，进一步行通路分析说明了干扰素γ、干扰素α、白细胞介素2、白细胞介素7等相关通路在调节Treg可塑性方面的作用。证明AS促进了Treg细胞可塑性，导致功能失调的干扰素γ(+) Th1/Treg细胞的积累，这可能使动脉炎症进展。Sharma等[24]在小鼠AS斑块消退模型中证明了Treg的增加是消退斑块的常见特征，scRNA-seq结果显示，相较于进展AS斑块，在降脂治疗期间消退斑块中天然Treg标记物表达下降，表明其在降脂治疗期间被诱导，在使用CD25单克隆抗体消耗Treg表面受体后显示，Treg消耗阻止了斑块重塑，揭示了Tregs在解决AS中的作用，提供了控制斑块重塑和消退的途径。Wolf等[25]应用scRNA-seq分析发现载脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)特异性T细胞在AS的小鼠和患者体内增多，并逐步转化为具有促炎特性的致病性TH1/TH17样细胞，提示apoB特异性T细胞是AS抗炎治疗的一个新靶点。另有国外研究者对近期脑梗死的患者颈动脉斑块应用单细胞蛋白质组和转录组分析，发现与无近期脑梗死的患者相比，有近期脑梗死的患者颈动脉斑块中一种CD4+的促炎性T细胞亚群的浸润增加，可能使这些患者未来面临更高的心脏事件风险[26]。

2.1.3巨噬细胞巨噬细胞是AS的重要调节因子，其分泌细胞因子，处理脂蛋白和胆固醇，形成泡沫细胞，并吸收凋亡细胞，引发AS形成[27]。Kim等[28]使用scRNA-seq在AS的主动脉内膜中分离出了各种巨噬细胞亚群，展现了泡沫和非泡沫巨噬细胞的转录组谱，发现与非泡沫巨噬细胞相比，泡沫巨噬细胞表达的炎症基因少，但脂质加工基因增多。内膜非泡沫巨噬细胞形成了在AS主动脉中表达白介素-1β和许多其他炎性因子的主要细胞群，提示含脂斑块巨噬细胞并不是导致病变炎症的斑块巨噬细胞。另一项研究结合使用scRNA-seq首次了解到AS的进展和消退过程中单核细胞向巨噬细胞过渡的特征，分析显示巨噬细胞的激活比传统的向M1型和M2型巨噬细胞极化更加复杂，还鉴定了具有干细胞样特征的增殖性单核细胞，表明单核细胞可能在炎症组织中以增殖性自我更新状态持续存在，而非进入组织后立即分化为巨噬细胞[29]。单细胞测序还可结合活体显像技术研究细胞形态及运动轨迹。Mcardle等[30]通过scRNA-seq确定了小鼠AS斑块中巨噬细胞亚群的关键标记趋化因子CX3C受体1(C-X3-C motif chemokine receptor 1，Cx3cr1)和CD11c，然后，将这些标记物与绿色(Cx3cr1)或黄色(CD11c)荧光报告物相连的小鼠进行工程化，使巨噬细胞发出绿色、黄色两种颜色(双阳性)或完全不发光(双阴性)。小鼠颈动脉斑块的显微镜观察显示，绿色和双阳性细胞倾向于停留在一个地方延伸突起，而黄色细胞则更为球形和具有迁移性，同时RNA分析也显示迁移基因在黄色细胞中表达上调。这项工作提供了对斑块巨噬细胞动力学的初步了解，并为研究这些行为如何影响AS进展提供了技术资源。Cochain等[31]应用Seurat软件包分析了AS患者主动脉scRNA-seq数据，确定了3个巨噬细胞亚群和单核细胞衍生的树突状细胞，推测了每种细胞类型的功能，并且观察到部分巨噬细胞中存在一种先前从未表征的髓系细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)的表达，TREM2 +巨噬细胞几乎只在患病主动脉的细胞中观察到，为探索独特的巨噬细胞群及其在AS中的功能提供新的证据。对AS斑块内免疫细胞的特征和表型的更多了解可能有助于今后制定更精确的心血管免疫疗法。

2.2单细胞测序技术与AS血管壁细胞机制

2.2.1 AS平滑肌细胞血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是AS斑块各个阶段中的主要细胞类型，除收缩功能外，越来越多的证据表明VSMC比以前认为的更具可塑性，可转化为包括类似泡沫细胞，巨噬细胞，间充质干细胞和成骨软骨细胞的表型，在病理情况下还涉及清除血浆中的分子甚至死亡的细胞，对AS的发展产生积极或消极的影响[32]。为揭示AS过程中VSMC的分化轨迹，Pan等将单细胞基因组学结果与VSMC分类图谱进行联合分析，发现在小鼠和人的AS斑块中，VSMC会先衍生为一种中间细胞状态——“SEM”细胞，某些已知的干细胞、内皮细胞和单核细胞/巨噬细胞分化标记物均在“SEM”细胞中富集。该研究还利用单细胞数据的新算法metaVIPER分析确定了AS过程中控制VSMC向SEM细胞转化的多个调节因子。提供了通过调控平滑肌细胞表型转换来治疗AS的新潜在治疗靶点[33]。Wirka等[34]用单细胞转录组技术发现了在AS病变中VSMC表型转化过程，其中部分平滑肌细胞转化成一种独特的纤维母细胞，被称为“fibromyocytes”，在VSMC中敲除可导致冠状动脉疾病的基因TCF21可显著抑制VSMC的表型转化，导致病变内“fibromyocytes”减少，最终抑制AS的进展。Chattopadhyay等[35]对高脂血症小鼠AS组织中scRNA-seq细胞亚群分析证明暴露于游离胆固醇后，VSMC降低了收缩标志物的表达，激活转录因子Klf4(Krüppel-like factor 4，Klf4)，上调巨噬细胞和成纤维细胞标志物的亚群，这些标志物与AS的形成相关。而抑制未折叠蛋白反应(unfolded protein response，URP)可阻止Klf4的激活，减少VSMC出现上述转化，减轻斑块负荷。人类DNA修复酶NEIL3(nei like DNA glycosylase 3，NEIL3)缺乏可加速AS的进展[36]。组蛋白变体H2A.Z是常规组蛋白H2A的重要变体之一，在发育和疾病中发挥重要作用。Yao等[37]基于单细胞转录水平分析了2名AS患者动脉中的VSMC群体，鉴定出维持VSMC特性的关键调控因子-组蛋白变体H2A.Z。与正常动脉相比，患病血管组织中H2A.Z表达显著降低，而H2A.Z过表达后可以挽救损伤引起的VSMC去分化，抑制内膜增厚，提供了组蛋白变体在维持血管细胞特性和AS潜在治疗靶点的新见解。

2.2.2AS内皮细胞和血管外膜细胞血管内皮细胞功能异常是AS形成的始动环节。Khan等[38]应用scRNA-seq方法鉴定了糖尿病相关AS中内皮的转录特征。将对照和糖尿病小鼠的主动脉细胞进行流式细胞荧光分选后测序，确定了糖尿病相关的AS内皮细胞异常失调的十七个基因，包括血管内皮干细胞(vascular endothelial stem cells，VESCs)的标记物蛋白C受体，推测糖尿病可能通过靶向VESCs限制血管修复过程加速AS进程。先前对AS的机制研究主要集中在内皮细胞和平滑肌细胞，近年的研究表明血管外膜具有重要的生物合成和炎症调节能力，参与血管重塑过程[39]。Gu等[40]用scRNA-seq检测了正常和ApoE缺陷小鼠AS主动脉外膜，Seurat软件聚类分析描绘出外膜的异质性细胞图谱，揭示外膜细胞包括了外膜间充质干细胞、免疫细胞(巨噬细胞、T细胞和B细胞)和一些稀有细胞类型，促炎症细胞群体，体外transwell试验证实Sca1+血管外间质干细胞增加了趋化因子CCL2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)的分泌，吸引免疫细胞迁移至ApoE缺陷小鼠外膜，促进炎症反应，在AS的早期阶段发挥作用。

3 结语与展望

单细胞测序技术已经开始用于揭示AS的细胞组成、免疫细胞状态、细胞表型转化过程、以及细胞间的复杂作用机制，对AS的起因、发展和治疗奠定理论基础。但是单细胞测序也具有自身的局限性，如转录本覆盖率的偏倚和低捕获效率。测序后生物信息学分析也是单细胞测序技术的瓶颈之一，期望未来能够建立起标准文件格式的数据库以便简化分析和数据共享。斑块微环境的核心因素(如胆固醇代谢改变、氧化应激、缺氧、凋亡和坏死细胞、高血糖等)如何影响AS，以及细胞间配体-受体通讯、空间转录组单细胞测序相关的AS研究还很少。目前应用单细胞转录组测序和细胞异质性研究仍是该技术用于AS的主要方法，这些研究集中对AS组织中所含有的各类细胞进行分群探索，期望揭示各细胞间的相互联系。因部分手段开发较晚，有待将单细胞蛋白质组学、单细胞免疫组、空间转录组等多组学技术整合，更好的为理解AS的起始，进展，消退和斑块破裂细胞类型之间的复杂相互作用提供参考。随着单细胞测序费用逐渐降低，未来可能逐步建立起单细胞测序数据和大量AS临床参数的关联性，以实现临床应用转化，为控制AS制定新的治疗策略，而不仅是控制血脂水平。