软骨细胞衰老与骨关节炎的研究进展

时孝晴，揭立士综述，殷松江，王培民审校

0 引 言

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是最常见的关节性疾病，由于人口老龄化速度的加快，对社会经济的影响与日俱增[1]。OA由多种风险因素引起，其中老龄和肥胖最为突出[2]。欧洲的一项流行病学研究显示，OA发病率随着年龄的增长逐步提高[3]。《美国国家健康访谈调查》提供的数据同样表明，症状性膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)发病年限在55岁至64岁之间达到峰值，并且该患病比率与年龄的增长呈正相关[4]。我国人口众多，老龄化社会逐步形成，由此带来的年龄相关性疾病更是凸显。中国《2018版骨关节炎诊疗指南》显示，相比其他症状性OA(髋OA、手部关节OA)，KOA的患病率为8.1%，发病率居首位[5]。随着OA的进展，晚期OA通常需要进行关节置换以减轻疼痛症状和残疾状态。在过去20年中，膝关节置换手术的使用量大大增加。然而，即便是人工关节置换，术后仍然有超过60%的患者面临长期疼痛，直接影响术后功能锻炼和生存质量[6]。了解衰老在OA发生发展中的作用，对于疾病的治疗以及新疗法的产生具有重要意义。因此，越来越多的学者开始关注细胞衰老在OA中的作用。本文将对软骨细胞衰老与骨关节炎关系的研究进展作一综述。

1 软骨细胞衰老

伦纳德·海夫里克(Leonard Hayflick)和保罗·摩尔黑德(Paul Moorhead)于1960年代首次提到“细胞衰老”一词，是指在特征性的细胞倍增后出现不可逆的细胞生长停滞现象[7]。细胞衰老被认为是信号转导过程，可导致细胞进入稳定的生长停滞状态，同时保持代谢活性。现被扩展描述为，不同应激因素诱导的持久性增殖停滞状态[8]。软骨细胞衰老可能是由两方面因素共同决定，包括应激诱导(DNA损伤、氧化应激、炎性衰老以及表观遗传等)和有限的原位复制能力[8]。众所周知，细胞衰老和年龄相关性疾病具有深层次联系，清除衰老细胞对其有益。

OA的病理机制涉及多种关节组织和细胞类型，但软骨细胞一直是涉及衰老研究的重点。软骨细胞是关节软骨中的常驻居民。关节软骨是高度分化的无血管和无神经组织，其结构和机械特性主要由软骨细胞产生的细胞外基质，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖决定[9]。软骨细胞衰老的典型特征包括细胞形态增大，端粒缩短，p21、p16和p53表达上调，活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高以及衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性升高等[10]。

2 软骨细胞衰老参与OA的途径

2.1 端粒理论端粒理论认为端粒缩短是衰老的主要标志和导致细胞衰老的相关因素[11]。然而，端粒是如何导致生物体衰老未有定论。端粒是核蛋白结构，由高度保守的六聚体(TTAGGG)串联重复DNA序列组成，位于每个染色体臂的末端，并具有维持基因组稳定性的功能[12]。端粒的长度随着细胞分裂而缩短，并且端粒的损耗与体外复制能力有关。Shelterin复合体是端粒结合蛋白的核心成分。Shelterin复合物在调控端粒长度、维护端粒结构和功能完整性方面发挥重要作用[13]。端粒短缩会导致Shelterin复合物失稳，进而破坏DNA损伤反应的抑制环节，细胞周期从G1进入G0期[14]。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，在缺乏端粒酶时，成年组织中的细胞分裂会侵蚀DNA，降低Shelterin结合。伴随着生物衰老的进程，细胞会产生并累积更多的分裂，进而导致端粒侵蚀和衰老的加剧[15]。OA领域的研究中，Martin等[16]研究证实，衰老相关的SA-β-Gal活性随年龄增长而增加，而软骨细胞有丝分裂活性和端粒平均长度下降，软骨细胞在体内发生复制性衰老。

2.2线粒体功能线粒体功能障碍是衰老的另一标志，近些年在OA的研究中引起了特别的关注。自由基理论提出，过量的ROS引起的细胞损伤，实质上会促进衰老表型的加剧与年龄相关性疾病的病理进展[17]。年龄相关性线粒体功能障碍会引起ROS的过度累积，并进一步导致ROS与细胞抗氧化能力的失衡[18]。同时，除细胞损伤，ROS水平升高带来的年龄相关性氧化应激，能够通过干扰细胞信号传导促进疾病发展[19]。当存在过量的ROS时，半胱氨酸的氧化作用会使得半胱氨酸次磺酸变为亚磺酸(Cys-SO2H)或磺酸(Cys-SO3H)，进而导致氧化还原敏感蛋白失活[20]。

在衰老进程中，线粒体功能下降，线粒体功能障碍，氧化应激和衰老表型之间具有明确的因果关系[17]。研究证据表明，与正常软骨细胞相比，OA患者的软骨细胞具有更低的线粒体质量和线粒体DNA含量，以及电子传输链蛋白和参与线粒体生物发生蛋白水平的下降[21]。此外，相比年轻人，从老年人的软骨中分离出来的软骨细胞更容易受到氧化应激的影响[22]。总的来说，ROS作为软骨细胞中至关重要的次级信号分子，值得在衰老和OA中进行进一步研究。

2.3表观遗传因素表观遗传学是指基因表达调控机制的改变，而基础DNA序列无变化。表观遗传学改变包括DNA甲基化，组蛋白修饰和非编码RNA的变化[9]。越来越多的表观遗传学研究表明，表观遗传调控基因表达在正常发育、衰老和OA的病理机制中占据重要地位[23]。在正常的关节软骨细胞中，大多数分解代谢的蛋白酶不表达或表达水平较低，这可能是通过表观遗传机制(如DNA甲基化)导致的转录沉默[24]。但是，OA软骨细胞表达涉及一系列软骨分解代谢的基因。各种基质降解酶如MMP-3，MMP-9和ADAMTS-4的启动子位点的去甲基化与它们在OA中的表达增强有关[25]。生长因子，如转化生长因子-β，骨形态发生蛋白和胰岛素样生长因子-1等参与了软骨细胞的分化和功能构建，其中OP-1在成年人关节软骨细胞活动中更为凸显[26]。OP-1 mRNA在成人关节软骨中表达，其水平随着衰老程度和软骨变性而降低，这可能是OP-1启动子的DNA甲基化增加所介导[27]。软骨细胞分化和软骨形成需要转录因子SOX9，其对表达软骨特异性蛋白至关重要，并且年龄依赖性SOX9的表达与DNA甲基化和组蛋白甲基化有关[28]。

2.4DNA损伤应答 (DNA-damage response, DDR)含有核DNA的基因组不断受到各种刺激、损伤，这些事件会导致DNA骨架断裂，产生单链DNA(single-stranded DNA, ss DNA)断裂和双链DNA断裂(DNA double strand break, DSB)[29]。为修复DNA链断裂，会启动相关机制，这种调控机制由DNA损伤触发，引起细胞内的一系列相关反应，统称为DDR[30]。DDR使细胞能够感知DNA损伤，传导DNA损伤信号并激活信号传导级联反应，这些信号级联会引起包括细胞凋亡，细胞衰老在内的多种细胞反应[31]。如果DNA发生损伤且持续存在，将导致DDR信号延长，并以细胞衰老的形式延长增殖停滞周期[32]。相关学者发现，在体外培养的衰老细胞中能够观察到长期的DDR病灶中存在未修复的DSB，表明细胞衰老与位点检修时间延长具有相关性[33]。γ-H2A.X是DDR通路的一种典型标志物。组蛋白变体H2AX是DDR的关键组成部分，其在羧基末端迅速磷酸化，并在DSB位点形成γ-H2A.X[29]。许多DNA损伤修复蛋白的关键都需要H2AX，其在DNA损伤反应的早期阶段起着重要的作用。

核纤层蛋白(Lamin)包括两种类型(A和B)和其相关蛋白组成的多蛋白网络，其功能障碍会诱导DNA 损伤。核纤层在核周围构成网状结构，用于维持结构和调节基因表达和沉默，核纤层缺陷会导致染色体失稳[34]。Lamin是核纤层的主要成分，能够维持染色质和蛋白复合物的结构性，调节基因组稳定性，参与基因组稳态的调节[35]。Lamin B1是一种蛋白质，在人类由LMNB1基因编码，是衰老的另一个关键特征。Lamin B1缺失与表观遗传以及衰老相关的染色质结构(SAHF和SADS)相关[36]。

2.5p53，p16和p21途径在衰老细胞中，衰老相关基因(p53，p21Cip1和p16INK4a)的表达增加，并通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)而导致细胞周期停滞。在关节中p16INK4a和p21Cip1表达上调会导致关节软骨细胞衰老事件的增多。p53在软骨细胞中表达增高，表现出与OA软骨细胞相似的形态，并发生凋亡事件，p53表达下降与软骨细胞衰老或凋亡呈正相关[37]。OA软骨细胞中的DDR促进衰老表型的进展，并且上调p16INK4a的表达。同时，表达p16INK4a的软骨细胞失去正常表型并且增加了炎性细胞的表达，如IL-1β，IL-6和MMP13[38]。在模型中敲除OA软骨细胞的p16INK4a，恢复了基质降解与合成相关基因的表达[39]。衰老相关蛋白通过p53-p21-pRb途径和/或p16-pRB途径使Rb蛋白磷酸化，从而介导细胞衰老的发生[40]。体外细胞造模常使用过氧化氢和IL-1β作为诱导剂，分别产生氧化应激和炎症反应，通过p53-p21-pRb途径介导软骨细胞衰老，并能够诱导小窝蛋白-1(Caveolin1)和p38 MAPK的激活。Caveolin 1的过表达又可以诱导p38 MAPK活化，并损害软骨细胞产生Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖[41]。

2.6其他Franceschi等[42]提出了“炎症衰老”一词来描述随着年龄增长而出现的促炎状态。炎症和OA之间存在很强的联系，并且这种炎症状态会随着年龄的增长而放大并促进OA的发展[42]。软骨细胞衰老的同时常伴随着衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)的产生。SASP的一个特征是应激诱导的持久性细胞周期停滞和一系列促炎因子的产生[43]。SASP能够产生促炎性细胞因子和基质降解酶，参与关节组织的破坏，并且与其他细胞以及微环境进行交流，刺激邻近的细胞发生衰老[44]。

除细胞周期和SASP，衰老还能够调控包括自噬在内的其他细胞程序。自噬在软骨生物学中的作用为衰老、自噬以及OA之间提供了直接联系。衰老程度的增加以及代谢过程的降低，造成软骨细胞自噬行为减少[19]。

3 干细胞衰老

干细胞的衰老过程包括多种类型损伤的累积。衰老干细胞的内部病理变化是相互交联的，如自噬和蛋白酶体介导的蛋白降解，线粒体自噬和线粒体未折叠蛋白反应机制以及在自我更新分裂过程中，有毒蛋白质聚集体形成和功能失调线粒体的积累[45]。在稳态条件下，关节软骨依赖于软骨细胞的自我修复机制，以及间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)的自主和非自主功能[46]。相比胚胎干细胞和诱导多能干细胞等，MSC的分化潜力相对有限。MSC具有自我更新的特性，并被认为具有高成骨和成脂潜力[47]。

基础研究表明，MSC衍生的外泌体可以通过增加II型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达，降低MMP-13、ADAMTS5和iNOS表达量，使得软骨细胞免于凋亡，并阻止巨噬细胞活化，从而保护关节软骨[48]。临床试验同样表明，采用MSC治疗OA，能够减轻炎症状态和降低患者疼痛症状，且不良反应较少[49]。然而，很多证据表明MSCs具有治疗OA的能力，但仍存在几个问题。首先，注射后细胞的存活率低，无法预测细胞间相互作用的时间。其次，供体的适用性至关重要，从老年或其他不健康供体中分离出的MSC会导致效果的下降。

阐明干细胞衰老的机制对于了解衰老过程和制定与年龄相关疾病的新策略至关重要。然而，干细胞生物学的复杂性(与高度分化的体细胞相比)可能会为我们探索干细胞衰老的分子机制带来困难。

4 软骨细胞衰老的干预策略

从上述中可清楚地看到，与OA相关的衰老机制为了解OA关节内发生的分子机制提供有益的见识，有助于拓展治疗思路[50]。尽管衰老是不可避免的并且是不可逆的，但越来越多的证据表明衰老的过程及其速率可以被改变。因此，衰老相关的退行性疾病的治疗方法需要进一步研究。

4.1mTOR抑制剂mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可调控细胞过程，例如生长，增殖和蛋白质合成[51]。研究表明，mTOR在软骨的生长和发育，改变关节软骨稳态和OA相关的软骨变性中起着重要的作用[52]。mTOR由两个结构相似但功能不同的复合物组成：mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1能够调节细胞生长和细胞周期，促进大分子(蛋白质，脂质和核苷酸等)合成，抑制自噬并加速衰老，并且是PI3K和Akt途径的下游靶标[53]。mTORC2能够调控内吞作用，鞘脂的生物合成和细胞存活[54]。

近年来，诸多学者尝试将mTOR信号通路与OA的病理发展相联系。研究者发现，mTOR抑制剂的使用可延长寿命并延缓哺乳动物中与年龄有关疾病的发生。然而，雷帕霉素在长期使用带来了诸多副作用，例如免疫抑制和葡萄糖耐受不良[55]。mTOR抑制剂的许多副作用是由于对mTORC2的抑制，而抗衰老作用是对mTORC1的抑制，因此开发mTORC1特异性抑制剂或许更加有益[56]。

4.2Sirt6激活剂SIRT6作为长寿蛋白(Sirtuins)家族中的一员，具有多种催化酶活性，在抗衰老、染色质调节、转录调控、糖脂代谢、DNA损伤修复等生物学过程中起着重要的作用[57]。小鼠研究发现SIRT6在促进机体健康方面具有关键作用：SIRT6缺陷型小鼠的寿命缩短，并且导致衰老，癌症和代谢异常。然而，提高SIRT6水平可能会产生有益影响[58]。在衰老细胞中，p27被乙酰化，半衰期延长。基础实验表明，细胞衰老过程中Sirt6能够促进p27的降解：降低p27的乙酰化，导致其通过泛素-蛋白酶体通路降解，从而延迟细胞的衰老[59]。此外，人软骨细胞中缺乏SIRT6会导致DNA损伤和端粒功能障碍[60]。开发靶向性的Sirt6激活剂可能具有治疗OA的潜力。

4.3抗氧化剂前文已经阐述氧化应激在衰老和OA的之间关系。ROS水平升高对蛋白质，脂质和DNA造成氧化损伤，导致细胞和组织衰老。目前，已经报道了几种对OA有效的抗氧化剂。例如，植物来源的白藜芦醇对人OA软骨细胞中IL-1诱导的炎症表现出抗氧化和抗炎作用[61]。姜黄素可促进大鼠软骨细胞中的SIRT1表达来抑制PERK-eIF2α-CHOP途径，进而改善OA大鼠的关节进展[62]。槲皮素通过激活SIRT1 / AMPK信号传导途径抑制内质网应激，减轻氧化应激诱导的细胞凋亡，并阻止大鼠骨关节炎的发展[63]。在软骨细胞衰老与氧化应激领域，针对OA治疗的研究已逐步深入，进一步阐明该方法在延缓细胞衰老与抗氧化应激中的作用将是具有前景的。

4.4衰老细胞清除剂近年的研究表明，通过完全清除衰老细胞或抑制衰老细胞的分泌，被认为是治疗年龄相关性疾病的潜在策略。证据表明，细胞衰老与年龄相关性疾病的表型具有因果关系，去除衰老细胞可以预防或延迟组织功能障碍的发展[64]。体外培养OA患者的软骨细胞，选择性去除其衰老细胞，结果显示衰老和炎性标志物的表达下降，软骨组织细胞外基质蛋白的表达增加[65]。从关节中去除衰老细胞似乎是OA的潜在治疗方法。

衰老细胞相关的药物主要包括三种：Senolytics、SASP抑制剂和营养信号调节剂，其中又以Senolytics应用最为广泛[66]。Senolytics是一类选择性清除衰老细胞的药物。这些药物中有许多靶向衰老细胞中的抗凋亡体系，如BCL-2家族的蛋白质(BCL-2，BCL-XL和BCL-W)[67]。研究阐明，通过阻断促凋亡细胞蛋白质，能够引起衰老细胞的凋亡，选择性地清除衰老细胞。在OA小鼠的关节腔内注射选择性清除衰老细胞的试验药物UBX0101，能够降低关节内衰老细胞数量，减少SASP的表达并改善整体关节功能[65]。同时，研究者从OA患者的膝关节中采集软骨样本进行体外培养，并使用UBX0101进行干预，发现软骨组织中的衰老细胞数量明显下降[65]。虽然通过清除衰老细胞改善OA症状，延缓OA进程可能是一种有效的治疗方法，但临床试验仍然缺乏足够的证据。未来需要更多的大规模临床试验验证这一结论。

4.5其他microRNA (miRNA)能够调整细胞的生物学功能，其作为调节剂在细胞衰老中的作用研究越来越多。研究表明，在OA软骨中加入IL-1β，miR-24水平受到抑制，而p16INK4a表达增加[38]。OA治疗的一种可能是恢复和/或维持miR-24的表达水平，以抑制关节软骨细胞中p16 INK4a依赖性途径。随着年龄的增长，包括CRP、IL-6和TNF-α在内的促炎因子会全身性升高，从而导致慢性低度炎症状态[42]。Toll样受体(Toll like receptors, TLR)和TLR信号传导与OA之间的关系得到初步证实。TLRs在关节软骨细胞，滑膜，软骨下骨和髌下脂肪垫中表达[68]。在OA大鼠中的关节腔内注射蛋白聚糖-4(Syndecan-4, PRG4)，能够调节TLR信号传导途径，并抑制全身炎症，减轻疼痛[69]。这表明PRG4在OA的潜在治疗中，具有进一步研究价值。

5 结 语

随着世界人口老龄化的增加，全球范围内的OA人口将持续增长。OA涉及各种不同的效应因子，从炎症介质到表观遗传学改变。软骨细胞衰老在OA病理中起重要作用，表现出各种与衰老相关的表型。但衰老细胞表型非常复杂，必须谨慎使用生物标志物来鉴定衰老细胞。尽管近年来的研究有很大进展，但仍不清楚正常关节软骨或OA关节软骨衰老的具体机制。

在过去的十年中，高通量蛋白质组学、基因组学、代谢组学技术，结合生物信息学工具，确定了一些OA发病机制的关键分子，以及用于疾病诊断/预后的有用生物标志物。研究者专注于软骨细胞衰老相关机制的靶向组学策略将有利于OA的诊断和治疗，对阐明驱动软骨细胞衰老的分子途径具有重要价值。

靶向清除衰老细胞可能是治疗OA的一种方式，但仍难以就衰老细胞在骨关节炎疾病中的致病作用得出结论。深入理解细胞衰老的基本机制以及如何在这期间进行良性干预，可能会为此类患者带来新的治疗策略。最后，了解衰老细胞对创伤的免疫反应及其已知的衰老缺陷之间的联系可能会更为全面的探索疾病机制和其他治疗靶标。