多不饱和脂肪酸代谢产物氧脂对氧化应激的调节作用

弓 剑 ， 晓 敏

（内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古呼和浩特010022）

氧化应激是由于促氧化剂的生成和抗氧化系统之间的不平衡导致的。 环境应激（热、冷）、管理应激（分群、运输）、营养应激（营养物质缺乏或不平衡）、代谢应激（妊娠、泌乳）以及免疫应激（反应过度）等诸多因素均可导致氧化应激。其结果是引起蛋白质、脂质和DNA 等生物大分子的氧化损伤或破坏，最终影响动物的生产性能、生殖机能、免疫功能、 动物产品品质以及动物健康。 在氧化应激对动物的不利影响中， 对免疫功能尤其是炎症的影响一直是人们关注的热点。 氧化应激可通过激活核因子κB（NF-κB）等信号通路诱导炎症，而炎症反过来又可诱导氧化应激， 如果氧化应激不能被及时解除， 将会形成一种氧化应激与炎症之间的恶性循环， 其结果是导致不可控或功能异常的炎症反应， 表现为低程度持续存在的慢性炎症（Sordillo 和 Raphael，2013）。 研究表明，氧化应激诱导的炎症（尤其是慢性炎症）是包括动脉硬化、糖尿病、肥胖、乳房炎等许多疾病发生的病理原因（Mattmiller 等，2013）。 因此，了解氧化应激的发生机制及调节因素， 并针对性地通过营养干预策略阻止或减缓氧化应激的发生， 对于优化机体的免疫功能进而预防疾病的发生具有重要的意义。 多不饱和脂肪酸（PUFA）经氧合代谢可生成多种脂质代谢产物，统称为氧化脂质，简称氧脂。 氧脂对炎症的启动、发展和消退具有重要的调节作用，例如，前列腺素 E2（PGE2）和白三烯 B4（LTB4）具有很强的促炎作用，而 PGD2和脂氧素 A4（LXA4）具有抗炎或促进炎症消退的作用。 近年来越来越多的研究证据表明， 氧脂也具有调节细胞内氧化还原状态的作用，其中，一些氧脂能促进氧化剂的生成或本身就是活性很强的氧化剂， 而有的氧脂具有抑制促氧化剂生成或促进抗氧化剂生成的作用（Mavangira 和 Sordillo，2018）。可见，氧脂的生成模式不仅影响着炎症的发展方向， 而且也影响着细胞的氧化还原状态， 提示其在调节氧化应激和炎症反应的平衡方面起着关键的枢纽作用。 关于氧脂对炎症的调节已有许多文献报道， 作者在以前的文章中也曾详细阐述了氧脂对炎症反应的调节作用 （弓剑和晓敏，2017）。 因此， 本文主要阐述PUFA 代谢产物氧脂对氧化应激的调节及其机制。

1 氧化应激概述

几乎所有的需氧生物在生命活动过程中都会产生活性氧 （ROS），ROS 是一类含有一个或多个未配对电子的小分子物质， 包括自由基和非自由基两种形式。氧自由基由于具有未配对的电子，因而极不稳定， 始终试图从其他化合物得到电子而得以完全还原，因而是一类活性很高的氧化剂。此外， 在一氧化氮合酶的催化下，L-精氨酸可以和氧发生反应生成一氧化氮（NO），而NO 和超氧阴离子反应可生成过氧亚硝基阴离子 （ONOO-），尽管这些被称为活性氮 （RNS） 的活性物质不属于ROS，但也具有很强的促氧化作用。

ROS 和RNS 对机体组织和细胞的功能具有双重影响，生理浓度下可作为信号分子介导增殖、分化和代谢适应等细胞活动过程。 尽管在先天免疫系统中，ROS 和RNS 的生成是先天免疫细胞杀伤入侵病原微生物的一种重要机制， 但这些物质的过量生成不仅不利于正常的细胞活动， 而且也不利于吞噬细胞对病原微生物的杀伤。因此，机体进化出强大的抗氧化系统用以处理ROS 以及RNS 等促氧化剂。 抗氧化系统主要由内源性的抗氧化酶和抗氧化剂以及日粮来源的抗氧化剂组成，酶和非酶抗氧化剂协同作用，保护细胞免受自由基诱导的细胞和组织损伤。归纳而言，抗氧化系统主要从三个水平实现对自由基的清除。 第一个水平是通过清除自由基生成的前体或灭活催化自由基生成的催化剂来阻止自由基的生成， 主要由超氧化物歧化酶 （SOD）、 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和金属硫蛋白完成；第二个水平是中断氧化链式反应，主要由维生素E、辅酶Q、类胡萝卜素、维生素A、抗坏血酸和尿酸完成； 第三个水平是修复和清除损伤和破坏的生物大分子，主要由脂解酶、蛋白水解酶、DNA修复酶、连接酶和聚合酶等完成。 然而，在一些特定的条件下（细胞代谢活动增强、炎症、疾病），促氧化剂的生成明显增强， 同时可能伴有抗氧化功能的降低， 当促氧化剂的生成超过抗氧化系统的处理能力时就会导致氧化应激（Valko 等，2007）。

2 氧脂对氧化应激的调节作用

PUFA 是一类脂肪酸碳链上含有2 个或2 个以上双键且碳原子数为18 ～22 的直链脂肪酸。ω-6（n-6）PUFA 包括十八碳二烯酸（LA）和二十碳四烯酸（ARA），ω-3（n-3）PUFA 包括十八碳三烯酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十二碳五烯酸（DPA）。由磷脂酶A2（PLA2） 催化从细胞膜脂质释放出来的PUFA 经相关酶途径代谢生成多种氧脂。 此外， 膜脂质中处于酯化状态的PUFA 也可直接通过非酶氧化生成少数氧脂。 氧脂合成的一般机制是从PUFA 结构中去除敏感的氢原子， 并同时或随后插入一个或多个氧分子。在酶介导的途径中，酶活性位点上自由基的形成是必需的，环氧合酶（COX）的自由基形成于活性位点上的酪氨酸残基， 而脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450（CYP）表氧化酶的自由基分别形成于活性位点上的非血红素铁和血红素铁，非酶代谢也遵循类似的机制（Milne 等，2015）。

2.1 COX 途径生成的氧脂对氧化应激的调节COX 存在组成性表达的COX-1 和诱导表达的COX-2 两种亚型。以 ARA 为底物，COX 途径生成的氧脂主要为2 系列的前列腺素和血栓素（TX），包 括 PGD2、PGE2、PGF2 和 PGI2 以 及 TXA2和TXB2。 患有乳房炎奶牛的乳腺组织中COX-2 的基因表达显著提高， 导致其下游氧脂的生成模式发生改变（Ryman 等，2015）。许多研究表明，COX-2 活化后可导致ROS 的生成增加，而这与COX-2途径衍生的氧脂有直接的关系 （Munoz 等，2015；Cho 等，2011）。 在炎症期间，PGE2是 COX-2 途径的主要下游产物，通过PGE2前列腺（EP）受体介导其作用。 研究表明，在阿尔茨海默症模型中，大脑PGE2的产生提高了ROS 的生成和氧化应激的发展， 而EP2和EP3受体的缺失降低了这些变化（Montine 等，2002）。对人肝细胞的研究发现，在细菌脂多糖 （LPS） 诱导下，PGE2生成增加引起的ROS 的生成与EP4受体激活引起的NADPH 氧化酶（NOX）系统的活化有关（Sancho 等，2011）。 在低硒日粮和抗氧化酶活性下降时， 患有乳房炎和子宫内膜炎奶牛PGE2的生成增加。LPS 诱导的牛子宫内膜外植体和上皮细胞PGE2的生成与EP2和 EP4受体的表达增强有关（Herath 等，2009）。 在PG 脱氢酶的作用下，PGE2可降解为无活性的15-酮基 PGE2（15-keto PGE2）。 因此，可以通过提高该酶的活性促进PGE2的降解进而降低其对ROS 的诱导作用。 也有研究表明，硒添加可上调PG 脱氢酶的基因表达（Kaushal 等，2014）。

已知具有血管扩张功能的PGI2也具有调节氧化应激的作用。 在小鼠急性肺损伤模型中，PGI合成酶过表达通过增强抗氧化酶醌氧化还原酶1（NQO1） 的基因表达来减缓博来霉素诱导的氧化应激（Zhou 等，2011）。 在小鼠脑损伤模型中，添加PGI2激动剂贝前列素钠提高了PGI 合成酶和PGI受体的基因和蛋白表达以及PGI2的生成，同时减缓了铝诱导的SOD 活性的降低和丙二醛（MDA）生成的提高， 因而减缓了铝诱导的氧化应激（Pan等，2015）。尽管氧化应激诱导的COX-2 的活化可提高PGI2的生成， 但同时氧化应激也具有抑制PGI 合成酶的作用。 对内皮细胞的研究发现，NO和超氧阴离子反应产生的ONOO-可通过硝酰化作用抑制 PGI 合成酶的活性 （Weaver 等，2001）。患有乳房炎奶牛的牛奶中以及患有子宫内膜炎奶牛的子宫和血浆中均发现了NO 的明显提高（Li等，2010；Blum 等，2000）。

COX 途径生成的PGD2可经脱水反应生成15-dPGJ2。 一方面，15-dPGJ2可激活过氧化物酶体增殖激活受体（PPARs）和抑制 NF-κB 信号通路下调COX-2 的基因表达， 降低促炎氧脂 （如PGE2）的生成，从而减缓氧化应激（Brigelius-Flohe和 Flohe，2017；Haskew-Layton 等，2013； Mendez和 LaPointe，2003） 。 另一方面，15-dPGJ2可通过激活抗氧化基因如血红素加氧酶-1 （HO-1）、SOD、GSH-Px 以及铁蛋白的表达促进抗氧化酶和抗 氧 化 剂 的 生 成 （ Shibata，2015；Lutzow 等 ，2008），减缓氧化应激。

2.2 LOX 途径生成的氧脂对氧化应激的调节LOX 存在 5-LOX、8-LOX、12-LOX 和 15-LOX 四种亚型，超氧阴离子和H2O2均可使LOX 活化。LA和ARA 经LOX 途径代谢可分别生成羟基过氧十八碳二烯酸（HpODE）和羟基过氧二十碳四烯酸（HpETE）， 这些中间代谢产物本身就属于脂质氢过氧化物， 因而可导致氧化应激。 不稳定的HpODE 和HpETE 可进一步依次代谢为相应的羟基衍生物 （HODE 和 HETE） 和酮基衍生物（oxoODE 和oxoETE）。 研究表明，围产期奶牛表现为氧化应激水平的进程性提高， 这可能与其乳腺组织中15-LOX 基因表达的显著提高有关（Aitken等，2009）。 患有乳房炎奶牛的乳腺组织中 9-HODE 和 13-HODE 以及 5-oxoETE 的水平显著提高（Ryman 等，2015），这提示了其上游相应的脂质氢过氧化物HpODE 和HpETE 的生成增加。 在牛主动脉内皮细胞中，13-HpODE 通过引起线粒体膜电位的丧失、 细胞色素c 的释放和提高线粒体Fe2+的摄取诱导了线粒体 ROS 的产生（Dhanasekaran 等，2005）。在人和大鼠肺内皮细胞和平滑肌细胞中，15-HETE 诱导了ROS 的生成，主要来源于线粒体电子传递链和NOX 系统（Li等，2016）。在吞噬细胞和上皮细胞中，氧化应激诱导了 5-oxoETE 的生成 （Erlemann 等，2007），而5-oxoETE 作为趋化剂可导致单核细胞和中性粒细胞向炎症部位的迁移， 这些细胞的呼吸爆发活动进一步加剧了氧化应激， 因而形成了氧化应激与炎症之间的恶性循环。

LX 是在炎症消退阶段由ARA 经LOX 途径代谢生成的一类氧脂，包括LXA4和LXB4两种亚型，目前对LXA4的功能相对比较清楚，通过已知唯一的受体甲酰肽受体2（FPR2）介导其作用，具有促进炎症消退和调节氧化应激的作用。 在细胞水平上，通过抑制NOX 蛋白复合体的组装，LXA4能够直接抑制白细胞依赖的超氧阴离子的生成（Hachicha 等，1999）。 LXA4对超氧阴离子生成的抑制作用同样也表现在其他ROS 和RNS 上，例如，LXA4抑制了中性粒细胞 H2O2（Weinberger 等，2008）和 ONOO-的生成（Filep 等，2005）。 LXA4还可以通过提高核因子E2相关因子（Nrf2）依赖的抗氧化基因的表达来调节氧化应激。 研究表明，LXA4预处理缺氧再灌注心肌细胞增强了Nrf2 的核转位，提高了HO-1 的mRNA 和蛋白表达以及其基因启动子的活性（Chen 等，2013）。

在炎症消退阶段，DHA 经LOX 途径可生成D 系列消退素（RvD）和 MaR，乙酰化的 COX-2 也可催化DHA 生成阿司匹林触发RvD（AT-RvD）。在巨噬细胞中，RvD1可通过抑制p47 和 gp91 亚基的装配和磷酸化抑制NOX 活性， 进而抑制ROS 的生成（Lee 和 Surh，2013）。 在啮齿动物急性肺损伤模型中，RvD1和 AT-RvD1激活了 Nrf2 及其下游抗氧化基因的表达 （Posso 等，2018；Zhao等，2016）， 降低了髓过氧化物酶 （MPO） 的活性（Hu 等，2019）和 RNS 的生成（Wang 等，2011）。 在CCI4诱导的小鼠肝损伤模型中，RvD1通过提高细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）的水平、SOD 的活性和HO-1 的基因表达发挥了对肝脏的抗氧化保护效应（Chen 等，2016）。 研究表明，在小鼠肝损伤（Li 等，2016）、 肾损伤 （Qiu 等，2019） 和皮肤炎（Cezar 等，2019）模型中，MaR1处理显著降低了超氧阴离子的生成和组织损伤。

2.3 CYP 途径生成的氧脂对氧化应激的调节CYP 途径生成的氧脂对氧化应激的调节作用与其所代谢的底物有很大的关系。 研究表明，以LA为底物生成的环氧十八碳烯酸（EpOME）提高了ROS 的生成和促炎反应及血管内皮细胞的通透性（Viswanathan 等，2003），而且当 EpOME 在可溶性环氧化物水解酶的作用下转变为二羟基代谢物（DiHOME） 时， 内皮细胞的通透性进一步增强（Slim 等，2001）。 相反， 以 ARA 为底物生成的环氧二十碳三烯酸（EET）对内皮细胞及其他细胞具有抗氧化和抗凋亡的作用 （Dhanasekaran 等，2006）， 这种效应与其激活Nrf2 进而引起抗氧化酶的基因表达提高有关（Liu 等，2015）。 然而，以ARA 为底物生成的另一种氧化脂质20-HETE 可提高线粒体ROS 的生成和激活NOX 系统（Han等，2013）。 当奶牛患有乳房炎时，牛奶中EpOME的水平提高， 血浆中11，12-EET 的水平降低，牛奶和血浆中20-HETE 的水平提高（Mavangira 等，2015），提示氧化应激水平提高。

当以EPA 作为底物时， 经CYP 途径可生成18（R）-羟基过氧二十碳五烯酸（HpEPE），这一反应也可被乙酰化的 COX-2 催化（Serhan，2014）。18（R）-HpEPE 进一步在 LOX 的催化下生成具有促进炎症消退的E 系列消退素（RvE）。 有资料表明，RvE 可直接抑制中性粒细胞中超氧阴离子的生成，这种效应主要是通过抑制NOX 蛋白的组装进而抑制其活性实现的（Takamiya 等，2012）。

3 总结

综上所述，PUFA 代谢生成的氧脂对氧化应激具有重要的调节作用，概括而言，主要是通过调节线粒体ROS 的生成、NOX 系统以及氧化还原敏感的信号通路实现对氧化应激的调节。 在动物生产过程中， 氧化应激是影响生产性能及健康的一个重要因素， 上述研究成果尽管多数集中于医学领域， 但对于在动物生产过程中通过日粮营养干预策略控制氧脂的生物合成进而调节氧化应激具有重要的借鉴意义和参考价值。 目前仅有为数不多的研究探讨了动物（奶牛）在炎症条件下的氧脂生成模式， 并没有针对性地探讨其对氧化应激的调节， 而这必将成为通过调节氧化应激进而优化动物免疫功能最终避免动物疾病发生和保证动物健康的一条新的途径。