非洲猪瘟病毒感染的分子机制研究进展

杨 旭

(恩施州动物疫病预防控制中心，湖北 恩施 445000)

0 引言

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是一种猪病毒性疾病，对家猪致死率高，而在猪瘟的自然宿主中无症状。在缺乏疫苗有效保护的情况下，ASF可造成重大经济损失，目前对ASF感染的控制主要为疫区的检疫及感染动物无害化处理[1]。ASF是由ASF病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染引起，ASFV是双链DNA病毒，具有较复杂的分子结构，属于非洲猪瘟病毒科，可通过节肢动物进行传播。该非洲猪瘟病毒最先于肯尼亚在20世纪20年代发现，之后迅速蔓延世界各个地区，2019年，我国首次报道了非洲猪瘟感染[2]。

1 病原学

ASFV是一种具有包膜结构、直径为200 nm的病毒。 病毒具有二十面形态，其基因组由约180 Kbp碱基的双链DNA组成，编码约160个开放阅读框(Open reading frame，ORF)。研究显示病毒主要在胞质中复制，病毒感染早期也可在胞核复制。病毒基因的转录受到严格的调控，目前已鉴定出四类病毒mRNAs，包括超早期、早期、中期和晚期转录基因。在DNA复制开始前超早期和早期病毒mRNA就已经表达，中间和晚期病毒mRNA的存在表明了ASFV基因表达调控的级联模型。病毒进入宿主的细胞质后其包膜中的相关因子即开始表达基因组复制所需要的各种酶[3]。

2 病毒吸附与侵入

ASFV可吸附到宿主细胞表面进入细胞。研究表明，这一过程是低pH和温度依赖性的，这与Vero细胞和猪巨噬细胞的内吞作用是一致的。然而，病毒的受体尚不清楚。ASFV感染细胞具有一定的限制性，说明病毒的感染过程需要特异性受体。CD163是一种巨噬细胞成熟的标志，是ASFV感染潜在的受体。最近的研究表明，病毒分离株Georgia 2007/1感染不需要CD163[4]。应用CRISPR/casa9技术的CD163敲除转基因猪感染非洲猪瘟病毒后，并无明显的临床症状、病理学变化、病毒血症和死亡率。以上研究提示CD163影响病毒的复制和感染过程。此外，单核细胞和巨噬细胞表面的部分标志物可能参与病毒复制和感染过程。除了病毒通过受体吸附宿主细胞外，也有迹象表明ASFV使用其他机制，如吞噬作用和胞饮作用。这些机制是利用单核细胞、巨噬细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)对该病毒进行分离时发现的。同时，如P12、P30和P54等的一些病毒结构蛋白也参与了病毒复制及感染过程[5]。

3 病毒内吞途径

ASFV通过内吞体(endosome)途径进入复制过程。内吞体的成分主要有蛋白质和脂类，这些蛋白质和脂类随病毒进入宿主细胞后被吸收到内质网膜中。Rab-GTPase蛋白家族是内吞体的主要调控因子。研究表明，在被吸附的很短时间内，可在早期内吞体中发现感染机体的病毒粒子。只有在早期才能发现已经包装成熟的病毒粒子，在感染中后期的成熟内体中没有观察到pH值下降。CD63是病毒内吞体成熟的表面标志之一，此外病毒成熟的标志还包括腔内小泡和表面标志Rab7的表达。当病毒颗粒成熟透过内膜后，可与内吞膜相互作用融合在一起。病毒裸核被释放到细胞质中并开始复制。研究表明，这一过程高度依赖于来自细胞内膜的胆固醇水平。胆固醇水平的阻断将导致病毒滞留在细胞内，并抑制病毒感染的过程。其他内体成熟抑制剂，如Wordtmannine，可能会阻止早期内吞体合成，而诺可达唑可能会干扰内吞体转运，防止ASFV感染[6]。

4 病毒基因表达和DNA复制

脱壳的病毒颗粒到达微管组织中心(MTOC)附近核周区的复制位点。在DNA复制开始前，超早期和早期DNA链都可以用作编码基因链。这可能与病毒核心的几种酶在病毒转录中的作用有关。DNA复制后，中晚期进行转录和翻译合成病毒蛋白，其余20%DNA负责转录和蛋白的修饰，这种转录和翻译机制使该病毒与宿主转录机制不同，在时间和空间上精确控制其基因表达。蔗糖梯度离心法对复制病毒DNA的沉淀分析表明，在病毒DNA复制的早期阶段，细胞核中合成了小的DNA片段，而后期细胞质中合成了大分子[7]。

5 病毒工厂的产生

微管是必要的运输病毒复制到核周区的结构。病毒工厂的形成需要微管的完整性，病毒颗粒的运输与稳定的微管有关。诺可达唑干扰微管丝的聚合，从而阻止病毒工厂的形成。结构蛋白P54在病毒感染过程中与动力蛋白互作，可能参与了微管转运病毒的过程。病毒颗粒组装位于靠近核心的胞质中，病毒核酸和蛋白积聚，新合成的病毒颗粒被组装起来。病毒工厂周围的纤维蛋白结构可以阻止病毒成分进入细胞质，使结构蛋白集中在组装部位。病毒复制位点的形成取决于许多因素。例如Rho-GTPase抑制剂可以通过积累前体和不成熟的病毒颗粒产生异常的病毒工厂。MTOC包含病毒DNA、大多数病毒蛋白、未成熟和成熟的病毒颗粒以及丰富的膜结构。首先病毒的衣壳和核壳结构域进行组装形成二十面体的前体。之后病毒核酸膜形成，这是病毒颗粒形态成熟的最后一步，由此产生成熟的病毒颗粒。驱动蛋白将成熟的病毒离子转出病毒工厂，转运至细胞膜表面，通过细胞出芽外排至细胞外。

6 病毒释放

成熟的病毒颗粒依靠经典驱动蛋白和衣壳蛋白pE170R，经微管通道从病毒工厂转运至细胞表面，最后通过出芽方式排出细胞外并获得一层外膜。研究显示，细胞内和细胞外的病毒都具有复制和感染特性，但其抗原性和免疫原性均有所不同，这在宿主对非洲猪瘟的免疫应答中起十分重要的作用[8]。

7 抗病毒复制药物

在疫苗研制及普及使用之前，抗病毒药物使用仍对该病的防控有一定的意义。抗病毒药物有助于病毒爆发后的早期控制。目前报道的ASFV的抗病毒药物包括白藜芦醇和氧化白藜芦醇、微藻、降胆固醇药物或胆固醇转运抑制剂、抗肿瘤的月桂基没食子酸盐、抗惊厥药丙戊酸钠、动力素抑制剂、氟喹诺酮类药物及丝氨酸蛋白酶抑制剂等[9]。这些药物可用于快速反应，减少易感动物，以便在疫情周围建立“安全区域”，从而控制感染的传播。此外，抗病毒药物与疫苗接种方案的结合可用于诱导有效预防疾病所需的免疫应答。