哺乳动物谷胱甘肽转移酶研究进展

杨 晨,耿月攀,田 然

(南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023)

1 GST的发现

对GSTs的研究最早可追溯到1961年,Booth等[1]在小鼠肝脏细胞提取液中发现一种能催化GSH与 2氯-4硝基苯反应的酶;1978年,Lawrence等[2]确定小鼠肝脏组织中存在一种不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶,命名为谷胱甘肽转移酶,标志着第一个哺乳动物GST基因的发现,开启了GST分子生物学研究的先河.

2 GST的分类和命名

哺乳动物GST目前分为3类:可溶性胞质GST(cytosolic)、线粒体GST(mitochondrial)和微粒体GST(microsomal). 可溶性胞质GST是由两个亚基构成的同源或者异源二聚体,每个亚基分子量约为23 kDa～30 kDa,由199～244个氨基酸组成. 亚基的不同组合形成多种同工酶,大大增加了GST在哺乳动物中的多样性,据现有研究报道,哺乳动物具有15～20个可溶性胞质GST[3]. 尽管对于GST的分类目前没有统一的标准,但前人根据染色体位置、亚基结构、氨基酸序列的相似性以及酶学特性等,将哺乳动物可溶性胞质GST分为alpha(α)、mu(μ)、pi(π)、theta(θ)、sigma(σ)、omega(ω)和zeta(ζ)等7类,同一类序列相似度大于40%,而各类间序列相似性小于25%.

可溶性胞质GST每个亚基均由独立的基因编码. 例如:α、μ、π、θ、σ、ω和ζ分别由GSTA、GSTM、GSTP、GSTT、GSTS和GSTZ编码,每个基因分别由7、8、7、5、5、5和8个外显子组成. 随着基因组测序技术的发展以及生物信息学研究工具的开发,越来越多的基因注释和染色体图谱的构建,揭示了GST基因在生物体中的基因组分布. 以人为例,人α-GST同工酶由5个功能基因(GSTA1-5)和7个假基因(GSTAP1-7)编码,聚为一簇,位于6号染色体上. μ-GST包含5个成员,由GSTM1-5基因编码,位于1号染色体,表明GST基因由基因复制进化而来,形成不同的GSTs. π、θ、σ、ω和 ζ-GST分别位于11、22、4、10和14号染色体上,并由1(GSTP1)、3(GSTT1、GSTT2、GSTT2B)、1(GSTS1)、2(GSTO1-2)和1(GSTZ1)个基因编码[4]. 随着越来越多的GST同工酶的发现,为了避免混乱,人们采用统一的哺乳动物GSTs命名系统[5],包括物种名前缀、GST类型以及亚基类型等,例如:HsaGSTM1表示该基因编码人μ类GST的1亚基.

线粒体GST仅包含Kappa类同工酶,是由226个氨基酸组成的二聚体蛋白,由 GSTK1基因编码,具有8个外显子,位于人7号染色体上,在哺乳动物中为单拷贝[6].

微粒体GST是GST 超蛋白家族中特殊的亚家族,与可溶性GST序列相似度较低(<10%),约150个氨基酸,包含I、II、III和IV四类成员,其中I、II和IV类同工酶存在于哺乳动物中,并与类花生酸的形成密切相关,因此,也称为类花生酸与谷胱甘肽代谢膜相关蛋白(membrane associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism,MAPEG). 人具有6个MAPEG基因,根据序列相似性,将 MGST2、白三烯C4合成酶(leukotriene C4 synthase,LTC4S)和脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase-activating protein,FLAP)归为I类;MGST1和前列腺素E2合成酶(prostaglandin E2 synthase 1,PGES1)列入IV类;II类仅包含MGST3. 微粒体GST亚基组成方式比较多样化,如:MGST1、LTC4S和PGES1主要以同源三聚体的形式存在[7-9],而FLAP则能形成单体、二聚体和三聚体等多种形式[10].

3 GST结构特征以及酶促反应

尽管不同类型GST具有很大的序列差异性,但其二级结构和高级结构是极其相似的. 可溶性胞质GST每个亚基均由包含βαβαββα结构基元(β2-α1-β1-α2-β3-β4-α3)的N末端结构域(结构域I)和一个纯α螺旋(α4)的C末端结构域(结构域II)组成. 相比之下,线粒体GST则是在βαβ基序增加了螺旋结构域,以负责结合亲电子底物,同时,提示可溶性胞质和线粒体GST在晶体结构上的平行进化[11]. 可溶性GST整个N末端结构域被认为是由硫氧还蛋白超家族折叠结构进化而来,如硫氧还蛋白和谷氧还蛋白等. 每个GST亚基都具有独立的GST的催化活性位点:结构域I 主要提供GSH结合位点,称为G位点,在哺乳动物中高度保守,例如:alpha/mu/pi-GST中的第七位均为酪氨酸(Tyr)以及theta/zeta第17位均为丝氨酸(Ser);结构域II 负责绑定疏水底物,即H位点,结构可变性较大[12-13]. 在催化反应中,GST与GSH的结合遵循酶和底物的“契合诱导机制”,即底物与酶结合后,诱导酶蛋白的构象发生相应的变化,从而使酶和底物契合而形成酶-底物络合物,并引起底物发生反应;当反应结束,产物从酶上脱落下来后,酶的活性中心又恢复原来的构象. 保守的G位点可促进酪氨酸/丝氨酸的羟基与GSH的硫醇基之间形成氢键而离子化,从而产生硫醇盐阴离子;而可变的H位点在结合疏水底物(亲电子化合物)后,参与由硫醇盐阴离子驱动的一系列反应[14]. 线粒体GST与可溶性GST具有相似的催化功能.

研究表明,微粒体GST具有3～4个跨膜结构域,蛋白质的氨基和羧基末端突出到膜的腔侧,而GSH和底物结合的位点可能位于面向胞质溶胶的环中[15-17]. 以上结果仅仅是对微粒体GST结构学上的预测,微粒体GST详尽的蛋白晶体结构仍有待进一步研究.

4 GST的表达和功能意义

随着生命科学的发展,研究领域的不断扩展,越来越多的新基因被逐步发现,而确定新基因的功能和遗传信息已成为极其重要的一项内容,因此,对哺乳动物GST功能的探究也成为科学家们所关注的热点. GST作为机体解毒系统中重要的组成部分,负责催化GSH与各种亲电子外源化合物(如:药物、工业中间体、杀虫剂、除草剂、环境污染物、致癌物等)的结合,在多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRP)的作用下将谷胱甘肽共轭物排出体外,从而防止亲电试剂在生物转化过程中与细胞生物大分子发生共价结合,起到解毒作用[3]. 尽管GST家族成员起源于同一祖先,但随着基因复制、重组和突变的累积,不同类别的GST在催化活性发挥上又表现出底物特异性和功能多样性. 例如,在人肝脏和肾脏中表达的alpha类成员GSTA1-4,虽具有高度同源的序列以及蛋白结构,但彼此却有着截然不同的底物结合特性. GSTA1、GSTA2和GSTA3倾向于结合2,4-二硝基氯苯(CDNB),对该类底物的催化活性显著高于烯醛类底物;相反,GSTA4则偏爱烯醛类化合物,对烯醛类化合物的催化活性是GSTA1的近200倍[18]. 研究表明,GSTA1和GSTA4具有特殊的底物结合口袋,位于α1-β1环和C末端的α4螺旋区中,该区域氨基酸的组装和位置决定了底物结合口袋的形状和特征,因此,也决定了二者底物识别的特异性[18]. 此外,Björnestedt等人还报道了GSTA1第Arg15和Tyr9位点在绑定和激活 GSH,维持酶活性上具有重要意义[19]. 进一步的研究同样揭示了多个影响GSTA4对烯醛类催化活性的关键位点,包括α1-β1环的Gly12,α4螺旋区的Ile107(Leu)、Met108(Leu)和Phe111(Val)以及C末端的Pro208(Met)、Tyr212(Ser)、Val213(Leu)、Val 216(Ala)和Pro222(Phe)等[18-19],促进了人们对其催化机制的理解.

此外,GST还具有非催化功能,例如GSTO1能调节兰尼碱受体,是一种内质网钙离子蛋白,通过抑制其活性,从而避免细胞凋亡[20]. pi-gst主要在胎盘、红细胞、乳房、肺和前列腺中表达. pi-gst是调节C-Jun氨基端激酶1(JNK1)的抑制剂,通过抑制MAP激酶信号通路的亚类—— JNK信号通路活性从而调控细胞凋亡、应激反应和细胞增殖等. Mu-gst成员GSTM1是细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)的内源性抑制剂,通过抑制ASK1活性,并阻止其进行低聚反应,调控压力胁迫或细胞因子诱导的细胞凋亡[21].

尽管大部分可溶性胞质GST同工酶分布于细胞质中,但也有部分同工酶位于线粒体、细胞膜或细胞核中. 例如,线粒体GSTA4就曾在人和小鼠中被报道. 研究表明,线粒体GSTA4高度磷酸化;并在分子伴侣Hsp70的帮助下进行翻译和定位到线粒体中;进一步研究显示,这种线粒体定位信号位于C末端20位氨基酸区域且需要蛋白激酶A(Ser-189)或蛋白激酶C(Thr-193)碳末端磷酸化位点的激活[22-23]. 相似地,在人肝脏微粒体中还发现一种与人GSTA1高度同源的同工酶,称为M-GSTA,该酶与细胞膜抗氧化损伤密切相关[24]. 另有,小鼠GSTO1[25]和GSTT2[26]在细胞核中的表达也相继被报道.

不同于可溶性 GST的组织特异性表达,Kappa类同工酶在各种组织中广泛表达,包括肝脏、肾脏、胃以及心脏等,并证实与肝脏、肾脏线粒体有关[27],提示线粒体GST是细胞代谢的基础[28]. GSTK1不仅存在于线粒体中,同时还存在于过氧化物酶体中,鉴于这两种细胞器在脂类物质代谢中的重要意义,提示GSTK1可能参与脂肪酸β氧化活化/转移以及脂类过氧化物解毒[6]. 此外,Morel等研究还发现,GSTK1的C末端Ala-Arg-Leu序列是过氧化物酶体靶向定位信号,提示C末端在过氧化物酶体定位中具有重要作用[6]. 尽管有研究表明GSTK1可能在分子伴侣热休克蛋白(Hsp60)的帮助下[11],或者借助线粒体导肽N末端的切割位点进入线粒体[6],但将GSTK1定位到线粒体的具体过程还有待进一步研究.

微粒体GST由于家族成员的复杂性,其功能也多样化,不仅具有GSH依赖性转移酶功能,同时还与一系列疏水化合物的合成和转运密切相关. 例如,MGST1主要负责与GSH有关的转移酶和同工酶催化反应,与可溶性GST功能类似. 研究发现,MGST1不仅在催化GSH与卤代芳烃(halogenated arenes)和多卤代不饱和烃(polyhalogenated unsaturated hydrocarbons)的偶合过程中具有重要作用[29],同时也参与脂质过氧化物(lipid hydroperoxides)的代谢(如脂肪酸过氧化物、磷脂过氧化物等)[30-31],提示MGST1是有机体不可或缺的解毒酶,尤其是针对外源有毒化合物以及氧化应激产物的解毒,具有重要意义. 此外,白三烯C4合成酶(leukotriene C4 synthase,LTC4S)、脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase-activating protein,FLAP)和前列腺素E2合成酶(prostaglandin E2 synthase 1,PGES1)分别参与类二十烷酸、白三烯和前列腺素的合成,在类花生酸合成通路中起作用,而 MGST2和MGST3基因则负责降低(S)-5-过氧氢-8,11,14-6-反式二十碳四烯酸[32].

5 GST多态性与疾病

近年来,广泛开展的GST基因多态性与疾病的研究有助于了解其在致癌物代谢、抗诱变、抗肿瘤以及细胞凋亡调节中的重要作用,并对开发新的疾病防御措施和提高整体治疗水平具有重要意义. 早在1988年,Seidegård等通过传统的分子克隆的方法,在人的肝脏组织中鉴定出GSTM1具有3个等位基因,分别为GSTM1*0、GSTM1*A、GSTM1*B. GSTM1主要在肝脏中表达,而其他成员则在肝脏外表达. 进一步分析发现,40%～60%的人群GSTM1*0等位基因发生了纯合缺失[33],使得该类人群具有较高的风险罹患肺癌和结肠癌[34-35]. 随后,GSTM3也鉴定出两个等位基因:GSTM3*A和GSTM3*B[36],并且两个内含子SNP在GSTM4中也被报道[37]. GSTP主要在肝外组织和肿瘤细胞中高表达[38],人群中具有两个SNP位点(I105V 和A114V)和四种等位基因,分别是:GSTP*A(I105/A114)、GSTP*B(V105/A114)、GSTP*C(V105/V114)和GSTP*D(I105/V114)[39-40]. Val-105位变异体提高对芳香环氧化物的催化活性[41],且此类人群易患睾丸癌和膀胱癌[42]. 两个GSTT等位基因在人群中被报道:GSTT1*0和GSTT1*1[43],前者在人群中完全丢失. 此外,20%高加索人等位基因纯合丢失[44],使得这类人更易患结肠癌、星形细胞瘤和骨髓增生异常综合症[45-47]. GSTZ在人群中具有3个等位基因,包含2个SNP位点:GSTZ1*A(A94～A124)、GSTZ1*B(A94～G124)和GSTZ1*C(G94～G124),不同的变异蛋白具有不同的底物结合特性[48]. MGST1具有4个多态性位点,其中2个位于内含子中,1个位于3′非编码区,另外一个位于启动子区;且具有GG/GG(102G>A/16416G>A)基因型的人群患结肠癌的风险较高[49].

6 GST的动物基因工程

研究表明,小鼠GSTA4对4-羟基壬烯(4-HNE)具有很强的催化活性. 4-HNE是一种强的亲电体,为米迦勒受体脂质过氧化反应的产物,与蛋白质、核酸和磷脂形成共价加合物. Engle 等报道,带有GSTA4纯合突变的小鼠更易受细菌感染,增加对百草枯(一种除草剂)的敏感性;并且基因敲除小鼠在大脑、心脏等组织中,GSH与4-羟基壬烯醛(4-HNE)的共轭活性显著降低,提示GSTA4基因的敲除降低了小鼠的解毒功能[50]. 然而,抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相关基因表达的上调可能是GSTA4基因敲除的另一补偿机制[51]. 进一步的生物信息学分析表明,GSTA4基因5′上游具有与小鼠醌氧化还原酶1(NADPH)基因相似的ARE,该结构促进4-HNE新陈代谢,提高机体GSTA4水平,暗示小鼠GSTA4基因在抗脂质过氧化中的重要作用[52-53].

GSTM5基因主要编码大脑/睾丸中的转移酶,但关于基因敲除后对小鼠的表型产生哪些影响,目前尚不清楚[54].

Pi-GST在小鼠中具有两个编码基因,即GSTP1和GSTP2,二者在致癌物,尤其是针对多环芳香烃类(PAH)化合物的解毒过程中发挥主要作用. GSTP1和GSTP2 突变小鼠的肝脏丧失对利尿酸的转移酶活性. 另有研究表明,GSTP1/P2-/-小鼠二羟甲基丁酸和对苯二甲酸诱发的乳突瘤数量是正常小鼠的近3倍,提示GSTP在抵抗外源化合物致癌过程中发挥重要作用[55]. 令人惊奇的是,GSTP1/P2-/-小鼠对镇痛剂乙酰氨基酚所致的肝毒性具有更强的抵抗力,这可能跟双基因敲除小鼠肝脏具有更快的GSH再生能力有关[56]. 此外,鉴于π-GST在促进对乙酰氨基酚代谢物-苯醌亚胺(NAPQI)的氧化还原循环过程中的作用,推断π-GST的缺失会削弱NAPQI的氧化还原循环,从而减少GSH[56].

Sigma-GST编码造血型或GSH依赖型前列腺素D2合成酶(HPGDS),负责催化合成一种在免疫反应中起重要作用的类花生酸——前列腺素D2;较野生型小鼠而言,该基因敲除小鼠呈现相对较弱的过敏反应[57].

GSTZ1基因编码马来酰乙酰乙酸异构酶(maleylacetoacetate isomerase,MAAI),在苯基丙氨酸/酪氨酸代谢通路中参与马来酰乙酰乙酸异构化,是酪氨酸代谢的倒数第二步催化反应. 生化水平研究显示,GSTZ1-/-小鼠酶活反应降低,削弱对底物马来酰丙酮和氯氟乙酸的识别[58]. 病理生理学研究进一步揭示,GSTZ1-/-小鼠同时降低了对琥珀酰丙酮和其他马来酰乙酰乙酸衍生代谢物的代谢能力[59]. 有趣的是,尽管GSTZ1同工酶缺失小鼠(3%丙基苯胺酸喂养BALB/c小鼠)会导致一系列病理学反应,如肝坏死、脂肪变形和外周白血病等,但同时引起alpha、mu和pi类GST以及醌氧化还原酶(NQO1)表达量的增加,可能是酪氨酸降低产物的堆积导致. 值得注意的是,这些表达量升高的基因都具有ARE(抗氧化反应元件)或EpRE(亲电反应元件),因此,推测zeta-GST还具有抗氧化和亲电子防御作用. 总的来说,酪氨酸代谢功能的紊乱是GSTZ1-/-小鼠肝脏解毒能力和抗氧化能力降低的主要诱因[59].

微粒体GST在哺乳动物中也具有多种功能,例如:MGST1、MGST2和MGST3具有解毒功能,FLAP、LTC4S和PGES1 各自在合成脂氧合酶、白三烯C4和前列腺素E2中起作用;此外,MGST2和MGST3也具有合成白三烯C4的功能[60]. 目前,第I 和IV类微粒体GST在基因工程小鼠中的研究不断被报道,显示MAPEG基因在过敏和炎症反应中的重要作用,但关于其在氧化应激中的功能目前尚未被报道. 在由酵母聚糖A引起的腹膜炎实验中发现,白三烯C4未在突变小鼠腹腔灌洗液中合成,却在野生型小鼠中显著增加,提示FLAP基因敲除小鼠丧失白三烯合成功能. 重要的是,在FLAP基因敲除小鼠中并未发现5-脂肪氧合酶通路的代谢产物,例如:5羟基二十烷四烯酸(5-HETE)和白三烯 A4等[61]. 由于5-脂肪氧合酶可将花生四烯酸转化为白三烯A4,并进一步转化为5-HETE,或与GSH结合生成半胱氨酸白三烯,因此,上述研究结果提示FLAP在整个白三烯合成过程中发挥至关重要的作用[61]. LTC4S基因敲除会降低LTA4和GSH的结合能力,同样影响白三烯的合成[62]. 与野生型小鼠相比,IV类PTGES基因敲除小鼠的巨噬细胞丧失了前列腺素E2合成能力;鸡II型胶原蛋白诱导的胶原性关节炎免疫实验中发现,PTGES基因突变小鼠对纤维增生、炎症、蛋白多糖损伤、细胞浸润和软骨损伤相关疾病具有一定的防御能力[63]. PTGES基因敲除小鼠神经元发热反应研究显示,实验小鼠虽具有完善的发热能力,但在感染细菌脂多糖后并未出现发热反应,且未有前列腺素E2的合成,提示PTGES是免疫诱发性发热的中枢开关,并有望成为治疗发热的靶向目标[64].

7 结论

谷胱甘肽转移酶是由多个基因编码,在机体生物转化、免疫等防御系统中具有解毒和抗氧化等多重功能的超家族蛋白酶. GSTs广泛存在于各种生物体内的各种组织细胞中,与细胞损伤、缺氧、中毒、衰老等多种疾病过程的发生有关. 但由于其存在多种亚型、具有表达组织特异性和底物特异性、与其他抗氧化酶产生相互作用,从而使其研究工作进展缓慢. 随着分子生物学技术和生物信息学的不断发展和应用,哺乳动物GSTs的序列、进化多样性、分子结构、抗氧化的具体机制等都能得到更好的阐明和实施.