响应面法优化超临界CO2 萃取红豆草缩合单宁工艺技术研究

袁英良，唐 丹，鲁 英，何建国，李成云，冉桂霞

（1.吉林省白城市畜牧科学研究院，吉林白城 137000；2.延边大学农学院，吉林延吉 133002；3.吉林省白城市洮北区畜禽产品质量安全中心，吉林白城 137000）

缩合单宁是一种多酚类化合物，存在于植物中。在反刍动物饲养中，缩合单宁作为纯天然饲料添加剂被广泛研究。研究表明，缩合单宁作为过瘤胃蛋白保护剂，具有提高动物对氮的吸收利用率，提高动物生产性能，预防瘤胃胀气及寄生虫病等作用（刘秀丽，2016）。红豆草是优质的豆科牧草，亩产可以达到4～5 t，因为其含有单宁，所以经常与苜蓿草进行混合播种，可以预防动物瘤胃胀气的发生（Huang，2018）。红豆草的单宁酸含量为2.5%～3.5%，其缩合单宁含量占总单宁的79%，是牧草中含量最高的（袁英良，2010）。因此研究红豆草中缩合单宁的提取工艺并增加提取率具有重要意义。

超临界CO2流体萃取技术是现今工业中的主要提取技术，具有无污染、无残留、提取率高的特点，已被广泛应用到食品、油脂、化学、包装、中草药、茶叶等领域（Zaniol，2020；Soumya，2017）。目前，提取缩合单宁的方式较多，但超临界CO2萃取缩合单宁的相关报道较少。响应面试验设计是通过构建二次回归模型，研究各因素及水平间的关系对响应值的关联性，并通过优化处理可得出试验因素水平之外的最佳工艺，结果科学准确、快速便捷，现已被广泛应用到各领域试验中（宋振康，2021；Roriz，2017）。缩合单宁的过瘤胃保护作用已经被充分证实，但是其提取工艺及效果还有待继续研究。本试验采用超临界CO2萃取技术手段，应用Box-Behnken 试验设计进行工艺优化，以提高红豆草缩合单宁的提取率，为缩合单宁添加剂研发及红豆草应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 红豆草由白城市畜牧科学研究院草地所种植基地提供，均在盛花期进行刈割。

1.2 试验仪器 Tlyon005150 超临界萃取仪（瑞士sitec 公司）；F160 型粉碎机（日本岛津）；C1-6735-01 型精密电子天平（日本岛津）；TU-1910紫外可见光分光光度计（北京普析）；TGL-10C 高速离心机（上海安亭）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程 红豆草→烘干→粉碎→称重→超临界CO2萃取→分离→提取液。

1.3.2 单因素试验 称取一定量的红豆草粉，应用超临界CO2萃取工艺，分别改变提取过程中的萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂种类、夹带剂流量，提取缩合单宁，应用紫外可见分光光度计测定缩合单宁含量，计算提取率。

1.3.3 Box-Behnken 响应面试验设计 参照单因素的试验结果，选择萃取压力、萃取时间、萃取温度、夹带剂流量四因素为考察因子，用Box-Behnken 响应面试验设计，然后采用二次多元回归方程拟合优化，最终选出最佳工艺，并记录缩合单宁的提取率理论值。响应面分析因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平

1.3.4 验证试验 将应用响应面试验优化后选择的超临界CO2萃取缩合单宁的最佳工艺按照实际操作情况进行调整，重复三次试验计算缩合单宁提取率平均值，与缩合单宁提取率的理论值进行比较，分析显著性。

1.4 统计分析 用Excel 软件进行数据整理，应用Design-Expert 11 软件进行响应曲面试验设计与结果分析并进行工艺优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 夹带剂的选择 本试验首先对萃取的夹带剂进行筛选，因为缩合单宁具有极性，所以选用极性溶剂作为夹带剂，由图1 可知，使用95%甲醇、95%乙醇、95%乙酸乙酯作为夹带剂依次分别较50%甲醇、50%乙醇、50%乙酸乙酯的提取效果好，其中50%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯的提取效率最高，综合考虑夹带剂对缩合单宁的提取率和成本影响因素，确定50%乙酸乙酯为夹带剂。

图1 夹带剂种类对缩合单宁提取率的影响

2.1.2 夹带剂流量对提取率的影响 由图2 可知，夹带剂的流量增大时，缩合单宁的提取率有所提高，但当夹带剂流量达到3.0 mL/min 时，缩合单宁的提取率开始下降，这可能是因为夹带剂的流量过快，造成流体中被萃取的缩合单宁被带出，造成提取率降低（刘嘉坤，2017）。但是夹带剂流量在2～3.5 mL/min 内差异不显著（P ＞0.05）。考虑到成本问题，选择最佳的夹带剂流量为2.0 mL/min。

图2 夹带剂流量对缩合单宁提取率的影响

2.1.3 萃取压力对提取率的影响 由图3 可知，当萃取压力在35 MPa 时缩合单宁的提取率最高，较25 MPa 时，提高17.65%，这可能是因为压力的增加，提高了被提取物质的析出能力。本试验选择萃取压力为35 MPa。

图3 萃取压力对缩合单宁提取率的影响

2.1.4 萃取温度对提取率的影响 萃取温度是保证夹带剂流动能力和有效成分分离的重要参数。由图4 可知，在温度超过40 ℃后，缩合单宁提取率出现下降趋势，这可能是因为在温度超过40 ℃时，超临界流体中携带的缩合单宁不能完全析出，造成提取率降低。综合考虑，温度对萃取机械的使用寿命和耗能等因素，萃取温度选择40 ℃较好。

图4 萃取温度对缩合单宁提取率的影响

2.1.5 萃取时间对提取率的影响 萃取时间是保证有效成分被充分溶解并提取的重要指标（Huang，2019）。由图5 可知，随着萃取时间增加，缩合单宁提取率呈先增加后趋于平稳的趋势，在120 min 时，提取率增加速度减小，提取率开始降低，这说明在120 min 后，虽然流体萃取剂能够较好地与样品接触并渗入样品中，但萃取时间过长反而会促使缩合单宁结构发生变化，所以提取效率不高（张建，2010）。在工业化生产中，时间直接影响到工作效率，所以最佳萃取时间确定为120 min。

图5 萃取时间对缩合单宁提取率的影响

2.2 Box-Behnken 响应面试验设计与优化

2.2.1 响应面试验设计结果及回归模型 按照表2 的试验方案进行试验后，对数据进行回归模型拟合，使用缩合单宁的提取率（Y）作为响应值，其对萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂流量的回归方程为：Y=89.14+0.96A-0.74B+2.03C+1.10D+4.08AB-0.50AC+AD-4.47BC-0.53BD-2.93CD-6.71 A2-11.96B2-10.17C2-12.05D2。结果见表2。

表2 Box-Behnken 响应面试验设计与结果

2.2.2 回归模型系数方差分析 由表3 可知，响应面回归模型达到极显著水平（P ＜0.00001），失逆项结果不显著（P ＞0.05），表明试验结果没有异常,可用于超临界CO2提取红豆草缩合单宁提取率的分析和预测。方程二次项CD 达到了显著水平（P ＜0.05）；方程一次项C，二次项A2，B2，C2，D2及二次项AB，BC 达到了极显著水平（P ＜0.00001），表明AB，BC 项有交互作用。

2.2.3 因素间交互作用 图6～图8 为两个因素对缩合单宁提取率的响应面及交互作用等高线图。响应面曲线越陡峭或等高线接近椭圆形表明两个因素的交互作用越显著（王婉愉，2018）。由图可以看出，萃取温度与萃取压力、萃取压力与萃取时间、萃取时间与夹带剂流量形成的响应曲面坡度较为陡峭，等高线为椭圆形，表明萃取温度与萃取压力、萃取压力与萃取时间、萃取时间与夹带剂流量两两相互作用对缩合单宁的提取率有较大影响，与表3 结果一致。这可能是由于当萃取温度、萃取时间、萃取压力及夹带剂流量达到相对较高程度时，溶解度下降，致使缩合单宁的提取率下降（李金凤，2020）。

表3 响应面模型方差分析及回归方程系数显著检验

图6 萃取温度及萃取压力影响红豆草缩合单宁提取率的响应曲面及等高线

图7 萃取压力及萃取时间影响红豆草缩合单宁提取率的响应曲面及等高线

2.2.4 最佳工艺优化及验证试验 通过响应面的优化，得出缩合单宁提取率最佳工艺条件为：萃取温度40.27 ℃、萃取时间123.09 min、萃取压力34.79 MPa、夹带剂流量2.02 mL/min，缩合单宁提取率的理论值为89.31%。根据实际操作情况，将最佳工艺进行修整改为：萃取温度40.3 ℃、萃取时间123 min、萃取压力34.8 MPa、夹带剂流量2 mL/min，经过验证试验，得到缩合单宁平均提取率为（89.23±0.0043）%，试验值与理论值没有显著差异。

3 讨论

超临界CO2萃取对不同极性物质都有较好的萃取能力。在萃取过程中添加夹带剂可以改变萃取时流体的极性，适宜的夹带剂具有提高有效成分流动速度和溶解率的能力（Diaz，2005）。缩合单宁是强极性物质，添加适宜的夹带剂可以提高缩合单宁提取率。王春雨（2019）对超临界流体有机溶剂进行研究，证实了溶液中有机溶剂残留率低，可以保证提取物的纯度，采用相同极性的有机溶剂能够提高有效成分提取率。刘雯等（2017）研究表明，夹带剂的加入量及流速分别为100～400 mL 及5～20 mL/min 时对银杏叶中总黄酮醇苷的提取率影响不显著（P ＞0.05）。这与本试验结果相似。萃取压力在萃取过程中直接影响被提取物的溶解程度，还可以增加CO2的浓度及夹带剂的浓度，使物质间的接触频率增加，最终影响被提取物的提取效率。段蕾等（2020）在油莎豆油提取的研究中表明,萃取压力影响超临界流体密度，同时过大的压力会对设备有损害，所以萃取压力不宜过大。萃取温度是红豆草缩合单宁提取率的限制参数，宋金慧（2014）在对葡萄加工剩余物的有效成分进行提取中，验证了适当增加萃取温度对提取物的分离具有重要影响。姜萍等（2005）在单宁酸提取中发现，温度过高会直接降低单宁酸的提取率。本试验优选了提取率，并考虑工艺中的成本因素，确定最佳的萃取温度。萃取时间影响着缩合单宁的提取率，当萃取时间超过临界点后，缩合单宁的提取率差异不显著。张学彬等（2021）在超临界CO2萃取辣椒红色素的工艺研究中也得出类似结论。响应曲面优化工艺被广泛应用到酚类物质的提取中，Ghafoor 等（2010）在多酚类物质的提取上应用了响应面曲面法优化工艺，使总酚提取率达到2.156 mg/100 mL。

4 结论

通过响应面试验设计及结果优化，超临界CO2萃取红豆草缩合单宁的工艺参数为：萃取压力34.8 MPa、萃取时间123.0 min、萃取温度40.3 ℃、萃取夹带剂流量2.0 mL/min、夹带剂50%乙酸乙酯，在此条件下，红豆草缩合单宁提取率达到89.23%。