丁酸梭菌对小鼠健康状况的影响

2021-12-05李玉鹏李海花尚智援张效生

中国饲料 2021年21期

李玉鹏，李海花，尚智援，张效生

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；3.天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

近年来，我国对丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的研究步伐正在逐渐加快。研究表明，丁酸梭菌作为重要的益生菌之一，不仅能够产生多种营养物质（丁酸、氨基酸、维生素、纤维素等）和酶类（消化酶、蛋白酶等），供给机体利用，并且具有抗炎和提高免疫力等作用（Li 等，2018；Liao 等，2015；王腾浩，2015）。但有关丁酸梭菌调节小鼠生长性能、血清细胞因子含量及紧密连接蛋白表达的机制仍不十分清楚。因此，本研究通过在小鼠上应用丁酸梭菌，研究其对小鼠生长性能、血清细胞因子含量和肠道健康状况的影响，为进一步揭示丁酸梭菌调节小鼠健康的机制，以及其在畜禽饲粮中的推广应用提供基础数据和理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计和饲养管理本研究采用单因子设计，选择32 只体况正常，体重为21.86 g 的昆明（KM）小鼠，按完全随机区组设计分为4 组，每组8 个重复。4 个处理组均饲喂商品饲粮，即对照组、丁酸梭菌组（CB）、产肠毒素大肠杆菌K88 组（ETEC）以及CB+ETEC 组。对照组用0.2 mL 生理盐水灌胃，CB 组用0.2 mL 2×106cfu/ml 的丁酸梭菌灌胃，ETEC 组用0.2 ml 2×108cfu/mL 的产肠毒素大肠杆菌K88 灌胃（该组攻毒前的处理同对照组），CB+ETEC 组攻毒前的处理同CB 组。攻毒24 h 后采集相关样品。正式试验周期为14 d，预饲期3 d，所有小鼠自由采食和饮水，期间观察小鼠健康状况并记录小鼠腹泻率和死亡率。

1.2 试验材料及其处理试验所用丁酸梭菌为实验室自己培养，原菌液活菌数为1×1010cfu/mL，试验前将其稀释到所需浓度。

1.3 生长性能在正式试验开始第1、7、14 天对小鼠称重，计算每组平均体重。

1.4 样品的采集试验结束时，在相对封闭的空间内用棉花蘸取乙醚，对小鼠进行麻醉，摘除眼球采血，当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠。将血液装于离心管中，置37 ℃温箱1 h，待血液凝固，血块收缩后，4000 g 离心10 min，取上清，-20 ℃保存备用。无菌条件下迅速打开腹腔，分离并采集回肠肠管，用磷酸缓冲液（PBS）冲洗干净置于冻存管中，-80 ℃保存备用。

1.5 指标测定及方法采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定血清中二胺氧化酶（DAO）、肿瘤坏死因子（TNF-α）以及白介素-8（IL-8）的含量（均购自美国BD 公司）。采用Western blot 检测回肠中靶蛋白ZO-1 和occludin 的含量（抗ZO-1 抗体、抗occludin 抗体和抗β-actin 均购自Abcam公司）。

1.6 数据分析以单只小鼠为单位进行试验数据统计，利用Excel 2016 对试验数据进行初步分析；采用SPSS 19.0 统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），统计结果P ＜0.05 表示差异显著，P ＜0.01 表示差异极显著。采用Graph-Pad Prism 5 软件进行图像处理及分析。

2 结果及分析

2.1 丁酸梭菌对小鼠生长性能的影响由表1 可知，在1～14 d 阶段，小鼠体重总体呈上升趋势，在第7、14 天时称重，与对照组相比，CB 组体重分别提高了5.79%和3.97%，但差异均不显著（P ＞0.05）。CB 组小鼠没有发生腹泻及死亡。试验结果表明，给小鼠饲喂CB，不影响其生长性能。

表1 丁酸梭菌对小鼠生长性能的影响

2.2 丁酸梭菌对小鼠血清细胞因子含量的影响由图1 可知，与对照组相比，CB 组小鼠血清细胞因子DAO、TNF-α 和IL-8 的含量无显著变化（P＞0.05），但DAO 的含量有下降趋势，降低了5.57%，而TNF-α 和IL-8 则与之相反，分别提高了12.41%和20.50%。在ETEC 攻毒后，CB 组DAO、TNF-α 及IL-8 的含量显著降低，分别降低了13.81%、29.61%和37.29%（P ＜0.05）。试验结果表明，ETEC 感染导致小鼠机体发生炎症反应，促进机体产生促炎性细胞因子，但是CB 能够降低ETEC 诱导的促炎性细胞因子的水平。

图1 丁酸梭菌对小鼠血清细胞因子含量的影响

2.3 丁酸梭菌对小鼠肠道紧密连接蛋白相对表达量的影响由图2 可知，与对照组相比，CB 组ZO-1 和occludin 表达量分别提高了40%和20%；与对照组相比，ETEC 组ZO-1 和occludin表达量分别降低61%和27%，差异均显著（P ＜0.01，P ＜0.05）；与ETEC 组相比，CB+ETEC 组ZO-1 和occludin 表达量分别提高了184.61%和24.66%，差异均显著（P ＜0.01，P ＜0.05）。试验结果表明，ETEC 感染能够导致小鼠回肠中紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 表达量下降，但是CB 能够逆转ETEC 造成的紧密连接蛋白表达下降。

图2 丁酸梭菌对小鼠回肠紧密连接蛋白相对表达量的影响

3 讨论

3.1 丁酸梭菌对小鼠生长性能的影响丁酸梭菌即丁酸梭状芽孢杆菌，对多种抗生素具有较强的耐药性，研究表明，其仅对新生霉素、万古霉素、四环素等几种抗生素敏感。且丁酸梭菌能够抵抗饲料制粒过程中的高温、高热，以及耐受机体胃液、胆汁酸、消化酶等的作用。因此，我国当前已在畜牧生产中逐步推广应用该新型益生菌（李玉鹏等，2017）。本研究结果表明，试验全程，各组小鼠均没有发生腹泻，成活率为100%，在保证小鼠原有营养水平的同时，给小鼠灌胃适量的CB，不影响其生长性能，且没有给小鼠的健康造成不良影响。

3.2 丁酸梭菌对小鼠血清细胞因子的影响丁酸梭菌能够分泌多种营养物质，既有直接的营养功能，又能够激活动物机体免疫系统，增强机体免疫力，维持动物健康。炎症反应是机体的一种自我保护，适度时能帮助机体清除病原体，但过度的炎症反应则会对组织造成伤害，甚至能够危及生命，因而，正常情况下机体的炎症反应与抗炎症反应是处于平衡状态的（李玉鹏等，2017）。二胺氧化酶（DAO）是一种高活性的细胞内酶，处于动物小肠黏膜上层绒毛中，其活性与黏膜细胞的核酸及蛋白合成高度关联，可以反映机体肠道中机械屏障的完整度和受损情况。肠屏障功能受损时，肠黏膜上皮细胞将释放DAO 进入血液（Shu 等，2016）。因此，血清中的DAO 活性能够在一定程度上反映上皮细胞黏膜的受损情况，常作为判断肠道通透性改变的内源指标（Zhao 等，2014）。肿瘤坏死因子（TNF-α）也是评判动物机体发生炎症反应的一个重要指标，入侵机体的外来病原体会刺激单核巨噬细胞产生TNF-α，然后诱导机体发生炎症反应（Feng 等，2016；Liu等，2009）。机体产生适量的TNF-α 时，能够促进损伤组织的修复，诱导肿瘤细胞凋亡，抵抗病毒感染等，且对免疫应答具有一定的调节作用，但过量产生时则会造成机体免疫平衡的紊乱（李海花等，2019）。作为机体炎性因子之一，IL-8 是一种较强的趋化性活性因子，与外来病原体等刺激物诱导的紧密连接蛋白表达的改变相关，在机体肠道发生的炎症反应中具有重要作用（Rostami等，2013）。通常当机体肠道发生炎症反应时，血清中TNF-α 以及IL-8 含量会显著上升，因此，二者能在一定程度上反映动物机体的健康状况（王柳懿等，2013）。研究表明，微囊化布拉迪酵母菌与微囊化粪肠球菌能够降低小鼠血清中IL-6与TNF-α 含量（张琳等，2020）。本研究表明，给小鼠灌胃适量CB 后，血清中的TNF-α 以及IL-8 含量有上升趋势，使小鼠处于免疫激活状态，适度地提升了机体的免疫力，并且能够降低ETEC 诱导的促炎性细胞因子的含量。

3.3 丁酸梭菌对小鼠肠道紧密连接蛋白相对表达量的影响肠道屏障与功能性紧密连接蛋白密切相关，单层肠上皮细胞通过紧密连接蛋白结合形成肠道屏障，能够有效阻止从肠腔进入血液的有害微生物、抗原和毒素（Séverine 等，2021）。紧密连接包括跨膜蛋白（封闭蛋白和闭合蛋白）以及各种被招募到顶外侧膜的胞浆蛋白，如紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2 和occludin 等，它们经细胞骨架影响细胞形态和信号传递（Heinemann 和Schuetz，2019），被公认为能够调节上皮细胞旁通路并在肠道通透性中发挥重要作用（He 等，2019）。研究表明，内源性或外源性毒素引起的炎症会导致肠道屏障功能障碍（He 等，2019），与本研究结果一致。研究表明，微囊化布拉迪酵母菌与微囊化粪肠球菌能够提高小鼠结肠中紧密连接蛋白occludin 和claudin-1 的表达量，缓解小鼠急性溃疡性结肠炎病症（张琳等，2020）。给断奶仔猪饲喂含丁酸梭菌的饲粮，能够提高其肠道中紧密连蛋白ZO-1、ZO-2、occludin 和claudin-1 mRNA 水平的相对表达量，降低机体炎症反应，改善肠道通透性，维护肠道上皮的完整性，有利于机体发挥肠道屏障功能（李海花等，2019；李玉鹏等，2017）。本研究表明，ETEC 感染能够降低小鼠回肠中紧密连接蛋白ZO-1 和occludin 表达，但是这种不利影响能够被CB 部分逆转。