长链非编码RNA H19在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中的作用研究*

肖 平 蔡桂程 陈文婷

(1. 海口市第三人民医院骨科，海口 571100)(2. 海南省人民医院血液内科，海口 570311)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞异常克隆性增殖的血液系统恶性肿瘤，大量异常单克隆免疫球蛋白的产生导致了靶器官功能损害[1]。虽然近年来，蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、自体干细胞移植对MM的缓解率和整体存活率起到了显著的提高作用，但是复发或肿瘤细胞的耐药使得MM仍属于难以治愈的恶性血液肿瘤[2]。硼替佐米(bortezomib)商品名万珂(velcade)，是一种可逆的蛋白酶体抑制剂，是目前MM一线治疗药物[3]，但是后期获得性的耐药使得硼替佐米仅仅是延迟疾病进展时间，对患者的整体存活率无显著影响。硼替佐米耐药机制极其复杂，目前仍未完全阐明[4]，长链非编码 RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码转录片段，其在基因转录中的作用逐渐受到关注，其在肿瘤发病机制研究中的研究成为目前研究的热点之一[5]，长链非编码RNAH19(lncRNAH19)在胚胎中高表达，出生后表达下调，Zhu等[6]研究显示lncRNAH19在多种恶性肿瘤中表达上调。本研究探讨了lncRNAH19在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中的作用。

1 临床资料和方法

1.1 临床病例资料

选取我院2017年2月—2018年12月治疗的初诊MM患者26例、硼替佐米化疗缓解MM患者25例及硼替佐米化疗后耐药复发MM患者22例。纳入对象：参照2017年修订的中国多发性骨髓瘤诊治指南诊断的MM患者[7]。排除对象：曾使用过免疫调节剂、自体干细胞移植或者其他生物治疗者，伴发其他恶性肿瘤者。另取我院健康体检者30例作为健康对照。对照组：男18例和女12例，年龄36～74岁，平均(58.24±11.34)岁；初诊MM组：男15例和女11例，年龄35～73岁，平均(58.21±11.27)岁；缓解MM组：男14例和女11例，年龄35～75岁，平均(58.28±11.38)岁；耐药MM组：男12例和女10例，年龄33～75岁，平均(58.19±11.24)岁，4组在性别及年龄方面均具有可比性，但差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验试剂和仪器

人多发性骨髓瘤细胞系OPM2购自国家细胞资源库；硼替佐米购自正大天晴药业集团有限公司；RPMI1640 培养基、胎牛血清购自Gibco；细胞总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光染料试剂盒、Lipofectamine 2000 转染试剂盒、CCK-8细胞活力检测试剂盒购自TaKaRa；lncRNAH19和内参β-actin扩增引物为上海吉凯制药技术有限公司设计与合成；siRNA-H19、siRNA-NC、lncRNA H19慢病毒载体以及空慢病毒载体由上海吉凯制药技术有限公司构建和提供，序列见表1所列；7000荧光定量Real-time PCR仪购自ABI；Med550酶标仪购自Bio-Rad。

表1 引物序列表

1.3 lncRNA H19表达的荧光定量Real-time PCR检测

抽取所有受试者静脉血2 mL，使用细胞总RNA试剂盒提取细胞总RNA，逆转录试剂盒反转录处cDNA第一链，每例样品取10 μg cDNA，加入lncRNAH19扩增引物和内参引物，使用荧光定量PCR试剂盒进行扩展，检测各样品荧光的变化，扩增条件：94 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，共反应40个循环。对照内参用2-△△Ct表示目的基因的表达水平。

1.4 慢病毒或干扰RNA转染OPM2细胞以及CCK-8细胞活力检测

人多发性骨髓瘤OPM2细胞于37 ℃、5% CO2条件下，培养于胎牛血清配制的RPMI1640 培养基，取对数生长期细胞接种24 孔板，每孔105个细胞，使用Lipofectamine 2000 转染试剂盒，转染siRNA-H19、siRNA-NC、lncRNAH19慢病毒载体以及空慢病毒载体(MOI=100)，设立对照，37 ℃、5%CO2条件下转染72 h，荧光下观察细胞转染率，PCR基因扩增鉴定转染效果，转染siRNA-H19的OPM2细胞标记为OPM2/si-H19，转染siRNA-NC的OPM2细胞标记为OPM2/NC，转染lncRNAH19慢病毒的OPM2细胞标记为OPM2/H19、转染空病毒载体的OPM2细胞标记为OPM2/Blank。

取对数生长期对照OPM2细胞、OPM2/si-H19细胞、OPM2/NC细胞、OPM2/H19细胞和OPM2/Blank细胞接种到96 孔板，每孔104个细胞，适应性培养12 h后，加入对半系列稀释的硼替佐米(0、3.125 nmol/L、6.25 nmol/L、12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L)继续培养48 h后，按照CCK-8细胞活力检测试剂盒说明书操作，加入CCK-8液，混匀，3 h后，酶标仪450 nm波长处测定各孔颜色的变化，参照对照计算IC50值。

1.5 统计学分析

资料输入SPSS 16.0软件进行分析，所有实验至少重复三次，计量资料采用t检验，多组均数比较使用方差分析，计数资料使用X2分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM患者中lncRNA H19表达的变化

由表2可知，对照组、初诊MM组、缓解MM组和耐药MM组lncRNAH19的2-△△Ct值分别为(0.107±0.032)、(0.324±0.067)、(0.218±0.042)和(0.486±0.095)，各组间具有显著性差异(P<0.01)。其中，初诊MM组显著高于对照组和缓解MM组(P<0.01)，耐药MM组又显著高于初诊MM组(P<0.01)。

表2 lncRNA H19表达的荧光定量PCR检测

2.2 过表达或低表达lncRNA H19影响了硼替佐米对人多发性骨髓瘤OPM2细胞的敏感性

转染后荧光显微镜下观察对照组无荧光，OPM2/si-H19、OPM2/NC、OPM2/H19和OPM2/Blank组细胞阳性转染率在90%以上，如图1所示。经PCR基因扩增后确认OPM2/si-H19组lncRNAH19表达显著减低、OPM2/H19组lncRNAH19表达显著增加，OPM2/NC和OPM2/Blank组lncRNAH19表达无显著性变化(图2)。

图1 lncRNA H19基因转染效率的荧光检测

图2 lncRNA H19表达的PCR检测

CCK-8细胞活力实验结果显示，对照组、OPM2/si-H19组、OPM2/NC组、OPM2/H19组和OPM2/Blank组细胞的IC50值分别为(17.86±1.64)nmol/L、(6.83±1.05)nmol/L、(18.04±1.72)nmol/L、(31.14±3.57)nmol/L和(17.75±1.68)nmol/L。其中，对照组、OPM2/NC组和OPM2/Blank组无显著性差异(P>0.05)，OPM2/si-H19组硼替佐米IC50值显著低于对照组(P<0.01)，OPM2/H19组硼替佐米IC50值显著高于对照组(P<0.01)(图3)。

图3 各组OPM2细胞的CCK-8细胞活力实验

3 讨论

MM仍然是一种无法治愈的疾病，其复发率高，耐药速度快是目前临床治疗的主要障碍[8]，因此探索其耐药机制既有利于对MM 疾病本质的认识，也可以为疾病的治疗提供新的靶点[9]。

lncRNA不编码蛋白质，但其可以参与基因组的表观遗传调控、转录调控以及转录后调控。陈林等[10]研究显示细胞外泌体中含量丰富，在肿瘤细胞中可以通过外泌体进行细胞间的传递。Shima等[11]研究显示lncRNAH19在癌症发生发展中发挥着作用。郭静等[12]研究显示高表达lncRNAH19的肝癌细胞以外泌体方式，通过激活蛋白磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，m TOR)(PI3K/AKT/m TOR)通路，增强其相邻肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以促进肝癌的发生、发展。于洁等[13]在宫颈癌的研究中发现lncRNAH19可以调控 Bcl-2表达影响宫颈癌细胞的生物学行为，裸鼠移植瘤实验显示抑制lncRNAH19表达后宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力也会得到显著抑制。本研究检测显示MM组lncRNAH19的2-△△Ct值显著高于对照组，说明了MM患者高表达lncRNAH19，提示了lncRNAH19可能也参与了MM的发生过程，进一步的分析显示耐药MM组lncRNAH19的2-△△Ct值显著高于初诊MM组，而缓解MM组lncRNAH19的2-△△Ct值出现了显著的减低，提示了高表达lncRNAH19可能参与了硼替佐米的耐药。

硼替佐米是目前治疗MM最有效的化疗药物，但获得性的耐药常常阻碍了硼替佐米长期疗效的发挥[14]，长链非编码RNA在表观遗传、转录及转录后调控等多层面调控基因表达[15]，在恶性肿瘤的发生、发展、耐药等过程存在很多潜在作用[16]。徐鹏翔等[17]在替莫唑胺抵抗的脑胶质瘤中发现lncRNAH19可以通过上调6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)mRNA的表达维持替脑胶质瘤对莫唑胺的抗性。Shima等[11]在乳腺癌的研究中发现，lncRNAH19可以上调醛脱氢酶1(ALDH1)表达，维持肿瘤干细胞的表型，而肿瘤干细胞正是肿瘤耐药的根源之一。本研究探讨了lncRNAH19在MM患者硼替佐米耐药中的作用，使用siRNA干扰OPM2细胞lncRNAH19后，硼替佐米对OPM2细胞的IC50值显著减低，使用慢病毒过表达lncRNAH19后，硼替佐米对OPM2细胞的IC50值显著升高，说明了lncRNAH19低表达可以显著增加硼替佐米对OPM2细胞的敏感性，lncRNAH19高表达可以显著降低硼替佐米对OPM2细胞的敏感性，上述结果提示了lncRNAH19高表达可能参与了MM的硼替佐米耐药，但其具体的作用机制本文未做深入探讨，为本研究的不足之处。

综上所述，本研究观察到MM患者lncRNAH19显著升高，尤以硼替佐米耐药MM患者为甚，高表达lncRNAH19可能参与了硼替佐米耐药过程，为硼替佐米耐药的克服提供了一个新的治疗靶点。