高脂饮食对生长期大鼠体质量和骨质量影响的研究*

阎国强 刘莉莉 梁 震 任 娟 舒 雄 赵丹慧

(1.北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所，北京 100035)(2.北京积水潭医院针灸科，北京 100035)(3.中国人民解放军火箭军特色医学中心，北京 100088)

儿童肥胖已经成为日益严峻的健康问题[1]，不仅是影响体质量，还影响到包括骨骼在内的多个器官和系统[2-4]。然而，肥胖对不同性别儿童骨内稳态和骨质量的影响还没有深入的研究。由于人类肥胖的原因大多是由能量摄入过多导致脂肪堆积，所以高脂饲料饲喂是最常用的建模方式。本研究采用高脂饮食喂养生长期SD大鼠的方法建立儿童肥胖模型，并探讨高脂饮食对雌、雄生长期大鼠体质量和骨质量的影响，并对差异性进行分析。

1 材料和方法

1.1 实验动物

24只SPF级21日龄 SD大鼠，雌雄各半，体质量50～60 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养于北京积水潭医院动物实验室SPF屏障设施内的IVC笼盒内，实验动物实验许可证号：SYXK(京)2017-0035。室温：23～27 ℃，相对湿度：(55±5)%，24 h恒温恒湿。12 h/12 h昼夜循环，自由进食饮水，3只/笼盒。本实验遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，按实验动物使用的3R原则给予人道关怀，并经北京积水潭医院实验动物伦理委员会批准，积伦动审字第201909-01。

1.2 饲料配方

1.2.1SPF级繁殖鼠料(g)：猪油(2.00)、酪蛋白(20.00)、玉米淀粉(26.00)、麦芽糊精(3.50)、蔗糖(35.00)、纤维素(5.00)、豆油(2.50)、柠檬酸钾(1.65)、磷酸钙(1.68)、碳酸钙(0.71)、无机盐(1.00)、维生素(1.00)以及胱氨酸(0.30)。其中钙含量(%)：1.10；磷含量(%)：0.60。

1.2.2SPF级60%脂供能高脂饲料(g)：猪油(31.66)、酪蛋白(25.84)、麦芽糊精(17.15)、蔗糖(8.85)、纤维素(6.46)、豆油(3.23)、柠檬酸钾(1.20)、磷酸钙(1.68)、碳酸钙(0.71)、无机盐(1.29)、维生素(1.29)以及胱氨酸(0.38)。其中钙含量(%)：1.10和磷含量(%)：0.60。

1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠(上海通善生物科技有限公司)；多聚甲醛(广州赛国生物科技有限公司)；Micro-CT(型号：Skyscan 1172，Brucker MicroCT)，电子天平(型号YHC-11001 A，瑞安市英衡电器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1动物分组：24只大鼠随机分为普食组和高脂组，n=12,各组雌雄各半。实验大鼠分别给予SPF繁殖饲料和60%脂供能高脂饲料喂养6周后，使用过量的3%戊巴比妥钠6 mL/kg腹腔注射安乐死取材。

1.4.2体质量检测：使用电子秤测量大鼠的体质量，每只大鼠测量两次，结果取两次测量数值的平均值。

1.4.3骨质量检测：微计算机断层扫描技术(Micro Computed Tomography，Micro-CT)，是一种非破坏性的三维成像技术，可以在不破坏样本的情况下，清楚了解样本的内部显微结构[5]。使用Micro-CT对大鼠右侧股骨进行扫描，扫描范围是股骨远端1/3部分，扫描参数为：电压45 kv；电流165 μA；曝光时间500 ms；旋转角度180°；旋转步长是0.4°；过滤器采用0.5 mm AL；扫描分辨率是8 μm。扫描完毕后使用系统自带软件(CTan，V1.14.4)对扫描图像进行数据分析和三维重建。扫描区域为股骨远端生长板上方100～400层，厚度为2.4 mm的松质骨。检测指标包括骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨表面积骨体积比(BS/TV)、骨小梁间隙(Tb.Sp)、骨表面积体积比(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 高脂饮食对大鼠体质量的影响

21日龄大鼠，两组比较，在雌性和雄性体质量均无统计学差异(P>0.05)。6周后大鼠的体质量均明显增加，与普食组比较，高脂组大鼠体质量明显增加，具有统计学差异(P<0.05)，且雄性大鼠体质量的增长速度更快，见表1。

表1 实验前后大鼠体质量的比较(g)

2.2 高脂饮食对大鼠BMD的影响

饲养6周后，与普食组相比，高脂组大鼠BMD均明显降低，但仅雌性大鼠BMD下降，具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 高脂饮食对大鼠BMD的影响(g/cm)

2.3 高脂饮食对大鼠骨微结构的影响

饲养6周后，与普食组相比，高脂组大鼠BV/TV，BS/TV和Tb.Sp出现明显降低(P<0.05)，而BS/BV和Tb.Th变化不明显(P>0.05)，见表3和图1。

表3 高脂饮食对大鼠骨微结构的影响

图1 大鼠股骨远端骨小梁三维重建图

3 讨论

人类肥胖的主要原因与能量摄入过多导致脂肪堆积有关，所以实验常采用高脂饲料诱导的营养性肥胖大鼠来研究肥胖的机制及肥胖引起的相关疾病[6-7]。大鼠在不同的生长阶段体质量增加的内容不同，幼年期主要以肌肉和骨骼为主，成年期主要以脂肪增加为主。目前，对于肥胖动物模型的评价标准尚不完全统一，如徐云鹏等[8]报道，根据大鼠体质量和 Lee’s 指数评估大鼠肥胖程度，筛选高脂组大鼠，将体质量和 Lee’s指数高于正常对照组并有统计学差异者认定为肥胖模型。除此之外，也有实验超过对照组平均体质量10%～15%作为建模成功标准，更加严谨的实验造模是Yang等[9]超过对照组平均体质量20%视为建模成功。本研究采用21日龄 SD大鼠高脂饮食诱导6周，高脂组大鼠体质量均超过普食组大鼠平均体质量10%，其中雌鼠和雄鼠的增长分别是11%和18.9%，证明肥胖大鼠模型建立基本成功，但未能达到理想值20%，原因可能是造模过程中存在肥胖抵抗的个体所致。SD大鼠的肥胖呈中心性肥胖，造模符合饮食诱导的腹心性肥胖[10]，适合研究长期高脂饮食造成的肥胖对骨代谢的影响。

根据Liab等[11]报道，在骨量指标中， BMD是最能代表骨含量的参数。实验饲喂6周后，雌性大鼠出现骨质疏松，而雄性大鼠的BMD虽降低，但尚无统计学意义，因此说明幼年雌性大鼠在高脂饲料诱导下更容易出现骨质疏松，这与Zhao等[12]临床研究发现的肥胖女童BMD和身体质量指数(BMI)之间存在关联的结果具有一致性，主要原因可能与雌性大鼠BMD开始上升及达到峰值的时间较早于雄性大鼠有关。

BV/TV为松质骨骨量评价常用指标，对于髓腔内松质骨而言，该比值能够反应不同样本骨小梁骨量的多少。BS/TV可以间接反映骨量多少。在骨微结构中，Tb.Sp为骨小梁之间的髓腔宽度，其增加提示骨吸收增加，可能发生骨质疏松[13]。造模后，与普食组相比，高脂组BV/TV、BS/TV及 Tb.Sp均显著降低，说明雌性和雄性大鼠的骨量都明显丢失。

BS/BV能够间接反应骨代谢状况，该值升高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，反之亦然。造模后，与普食组相比,高脂组BS/TV和Tb.Th无显著性差异，可能是由于未成年大鼠的骨活性或成骨能力未发生明显变化，只是出现了骨量的整体性缺失。高脂饮食对骨骼系统的影响并不是单一方向的，而是存在正向和负向的双重作用。一方面, 随体质量上升的脂肪和肌肉的质量对骨骼施加的机械负荷增加, 进而刺激骨转换, 促进骨量的积累; 另一方面, 脂肪过度积累带来能量代谢异常, 将改变体内激素水平及增加促炎性因子, 可引起骨代谢紊乱和骨量丢失[14-15]。

综上所述，经高脂饲料喂养的生长期SD大鼠可造成部分大鼠肥胖，其中雄性大鼠体质量增长速度更快，更适合做肥胖模型动物。高脂饮食能够诱导生长期大鼠出现成骨能力未降低的骨质疏松，形成骨量整体性缺失，且雌性比雄性更为显著。根据结果进一步推论，生长期的高脂饮食可能与骨质疏松具有一定的相关性，但本研究仅从骨的微结构方面进行了研究，今后将在更多层面就其机制的相关性进行深入实验探索。