热应激对ICR雌性小鼠超数排卵及卵泡发育的影响*

田永路 李 娜 田 祯 曾申明 朱德生

(1.北京大学实验动物中心，北京 100871)(2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193)

对于家畜等大多数恒温动物来讲，外界环境温度的变化超过动物机体的调节和适应区间时，导致大量热积于体内，使体温升高，从而出现繁殖机能障碍。一些研究[1-4]发现热应激能够抑制幼龄母牛和成年母牛的卵泡发育和功能以及促进卵子凋亡，而另一些研究[5-6]发现短时间的热应激对于在体外培养的卵子影响不大，因此判断，热应激对于离体和在体卵子发育的影响有所不同。

本研究主要探讨短期热应激对小鼠超数排卵和卵泡发育的影响，而卵泡闭锁又是卵巢卵泡发生过程中的重要生理现象。雌性动物从胚胎发育早期到出生时，卵巢中储存的大量卵原细胞开始发育，而绝大多数卵母细胞随着卵泡闭锁而凋亡，因此卵泡闭锁对于维持卵巢正常的生理功能具有非常重要的作用。如果卵泡闭锁出现异常，将对动物繁殖功能造成一定的影响。

1 材料和方法

1.1 动物选择与分组

7～8周龄的SPF级ICR小鼠20只，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006，小鼠饲养于北京大学实验动物中心屏障环境内，相对湿度40%～70%，温度22～26 ℃，在设施内适应3 d后进行实验。将20只小鼠随机分为对照组(25 ℃)和热应激组(38 ℃)，每组10只。实验通过北京大学福利伦理审查，编号：LAC-ZhuDS-1。

1.2 仪器及试剂

200 L生化培养箱和烘箱(上海一恒科学仪器有限公司)，CO2检测仪(河南省保时安电子科技有限公司)，电子体温计(临海医疗仪表厂)，离心机(Eppendorf)，注射器(浙江京环医疗用品有限公司)，冰箱(海尔)，切片机(Leica)，显微镜(Olympus)等。双蒸水(Millipore)，梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)和二甲苯(北京市通广精细化工公司)，苏木素-伊红(HE)染色液、明胶、中性树胶、4%甲醛、1.25%的三溴乙醇和操作液M2(Sigma)，以及10%盐酸乙醇(北京化学工业集团)。

1.3 实验处理

1.3.1热应激设备的预处理：实验前，采用CO2检测仪进行检测，当浓度为1 796.31 mg/m3时，其排放率为359.26 mg/m3/min，而实验小鼠的CO2排放速度每只为7.19～10.78 mg/m3/min。因此，上述生化培养箱能够同时进行30只小鼠的热应激处理。

1.3.2热应激前后的超数排卵处理：为了排除在热应激前形成的腔前卵泡和排卵前卵泡对实验结果的影响，本实验将用于测试的雌性小鼠在热应激之前，进行同期化超数排卵处理。热应激6 d后，再进行一次超数排卵处理，然后处死小鼠，取输卵管卵子以及卵巢。具体超数排卵处理为小鼠腹腔注射10 IU的孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后注射10 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。热应激组小鼠完成连续6 d的热应激处理的同一天注射hCG。

1.4 实验设计

对照组小鼠饲养于屏障环境内，温度控制在25 ℃，相对湿度40%～70%；热应激组小鼠，每天08∶00将小鼠放入38 ℃(实测温度在37～39 ℃)的生化培养箱中，热应激10 h，培养箱内相对湿度：40%～60%(培养箱底层放置水盘)，热应激期间自由采食和饮水，每天18∶00热应激结束后，将小鼠放回25 ℃屏障环境内饲养，连续处理6 d后，进行超数排卵处理，记录小鼠体质量后，采用1.25%的三溴乙醇对小鼠进行安乐死。

1.4.1卵母细胞的获取：75%乙醇消毒后，打开控温台。用操作液M2制作操作微滴：每滴50 μL(对每个液滴进行编号)；制备移卵管。将对照组和热应激组的输卵管置于微滴中，用尖头镊子划开膨大部，卵母细胞释放到操作液中。将含卵母细胞的团块转移至含0.3 mg/mL透明质酸酶操作液中，反复吹吸至卵丘细胞脱落。将脱净的卵母细胞，放入附近的新液滴中洗净后，显微镜下观察拍照。

1.4.2卵巢的获取及苏木素-伊红(HE)染色：将处死后的小鼠置于消毒后的操作台上，用75%乙醇对其腹部(朝上)进行消毒处理。剪开腹部皮肤和腹膜，摘取卵巢置于4%甲醛中固定保存。将固定好的卵巢制成石蜡切片，并取每个卵巢的最大面，连续切取三张，每张切片的厚度约为2 μm，然后进行HE染色以及后续的观察。

1.4.3卵巢卵泡形态观察：每只小鼠的一侧卵巢都取最大截面制作出一张HE切片，置于光学显微镜下进行观察。在视野下，统计所有卵泡总数(包括初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡，不包括原始卵泡)，闭锁卵泡数(颗粒细胞排列不规则及脱离卵泡壁)，如图1所示，计算总闭锁率(总闭锁率=闭锁卵泡/所有卵泡×100%)。

图1 HE染色闭锁卵泡判断标准(×200)

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 热应激对小鼠超数排卵的影响

通过对热应激组和对照组小鼠超数排卵情况的统计分析，发现热应激组的超排卵数高于正常对照组，热应激组为(55.10±6.16)个，对照组为(32.60±4.95)个，且两组之间存在显著性差异(P<0.05)。热应激组的正常卵泡数和异常卵泡数均高于对照组，热应激组正常卵泡数为(16.20±4.51)个，对照组为(8.60±2.73)个；热应激组异常卵泡数为(38.90±6.69)个，对照组为(24.00±4.61)个，但两种卵泡数均不存在显著差异(图2，P>0.05)。以上结果说明热应激只是影响超数排卵的总体数量，但并未影响正常发育卵泡的数量。

图2 排卵情况比较

2.2 热应激对卵巢总卵泡数和黄体数的影响

通过对卵巢切片HE染色后卵泡和黄体的统计分析，研究发现热应激组的总卵泡数明显高于对照组，热应激组为(30.25±9.16)个，对照组为(20.00±3.46)个，并且两组之间存在显著性差异(图3a，P<0.01)。热应激组黄体数高于对照组，热应激组为(9.50±1.77)个，对照组为(7.50±0.93)个，并且两组之间存在显著性差异(图3b，P<0.01)。以上结果说明，热应激不仅影响到了超数排卵后总卵泡数，并且影响到成熟的卵泡正常排卵形成黄体过程。

图3 卵巢切片HE染色后总卵泡数与黄体数比较

2.3 热应激对卵泡闭锁的影响

进一步分析热应激对于卵泡闭锁的影响，研究发现热应激组闭锁卵泡数高于对照组，热应激组为(4.80±1.15)个，对照组为(1.60±0.48)个，并且两组之间存在显著性差异(图4a，P<0.05)，而热应激组卵泡闭锁率高于对照组，但是两组之间差异不显著(图4b，P>0.05)。以上结果说明38 ℃热应激处理严重影响卵泡的闭锁。

图4 卵泡闭锁情况比较

3 结论与讨论

小鼠进行同期化超数排卵处理，热应激6 d后再进行超数排卵处理，发现热应激组小鼠的超排卵数、正常卵泡数和异常卵泡数均高于对照组小鼠，并且超排卵数较对照组，存在显著差异(P<0.05)。通过对卵巢切片HE染色的观察，发现热应激组的总卵泡数和黄体数均明显高于对照组，并且两组之间存在极显著性差异(P<0.01)，而卵泡闭锁率，热应激组高于对照组，但是两组之间不存在显著差异(P>0.05)。

从目前研究结果可以发现，热应激6 d对雌性小鼠超数排卵有一定影响，这与李颂孙[7]报道的结果类似。另外，闭锁卵泡升高说明热应激能够导致雌性小鼠繁殖功能的下降，这与Wilson等[8]发现热应激抑制卵泡发育与其功能的结果一致，但其机制尚不很清晰。Andreu-Vázquez等[9]研究也发现热应激会导致牛卵子加速老化，以及Tilly等[10]发现禽、猪、绵羊和牛在卵泡闭锁时，伴随颗粒细胞凋亡的现象。不同的热应激条件是否会引起卵泡中颗粒细胞凋亡，从而切断颗粒细胞为卵子提供营养的途径，最终造成卵泡闭锁，还是存在其他因素，具体作用机制需要更加深入的研究和探讨。