新型低温等离子体消毒机空气消毒效果的试验研究

马彩琴，许桂敏，王香妮，崔怡馨，刘 娜，石兴民，张冠军

（1.西安交通大学公共卫生学院，陕西西安 710061；2.长安大学电子与控制工程学院，陕西西安 710061；3.西安交通大学电气工程学院，陕西西安 710049）

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已成为世界范围内的重大疫情。研究表明，新型冠状病毒的主要传播途径包括呼吸道飞沫传播，并且也存在气溶胶传播的风险[1]，这使得空气成为该疾病的重要传播媒介，从而造成公共聚集场所通过空气传播的潜在危险。为此，采取适当的消毒技术，阻止新型冠状病毒等病原体通过空气传播，这对于控制疫情发展、保护人民生命健康、恢复国家经济正常运行具有重要意义。

据报道，在新型冠状病毒肺炎疫情期间，人们对空气消毒机的需求急剧攀升，市场上各种空气消毒机不断涌现，品种繁多。目前常见的空气消毒机主要有循环风紫外线空气消毒器[2]、静电吸附式空气消毒器[3]、高电压空气消毒器、臭氧空气消毒机等多种类型[4]。它们均具有杀菌效果可靠的特点，但由于存在消毒时间长、研制成本高、有毒性残留，并且对人体健康有潜在不良影响等多种不足及应用环境限制，因此，均不是当前最为理想的空气消毒方法。本研究装置是由本课题组在前期针对等离子体灭菌研究的基础上，以电晕为放电方式的低温等离子体空气消毒机，为研究其对空气中微生物的灭活效果，对该装置进行了小空间内自然环境和人工染菌环境中微生物的灭活试验研究。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与器材Tisch安德森六级筛孔空气碰撞式采样器（TE-10-800，北京赛克玛环保仪器有限公司）、微生物气溶胶发生器（TK-3，常州康华仪器制造厂）、隔水式恒温培养箱（GH-420ASB，北京科伟永兴仪器有限公司）、超净工作台（SW-CJ-2F，苏州安泰空气技术有限公司）、紫外线杀菌灯（GD-820，冠迪电器实业有限公司）、90 mm培养皿(苏禄医疗器械有限公司)、1.05 m3密闭有机玻璃腔体(自行设计加工)、臭氧分析仪(Model 202.2B Technologies,Inc)。

1.2 试验菌种金黄色葡萄球菌ATCC6538与大肠杆菌8099均为本实验室保存菌种。

1.3 主要试剂普通营养肉汤：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，PH7.4。普通营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 000 mL，PH 7.4。按照配方将配制好的培养基121℃高压灭菌20 min，然后将固体培养基在超净工作台中均匀倒入直径为90 mm的培养皿中，冷却固定，将液体及固体培养基倒置放于4℃冰箱中待用。

1.4 空气消毒机该实验采用的空气消毒机设备，整机尺寸：长×宽×高为25 cm×25 cm×10 cm，质量为3.5 kg，其结构示意图和实物图分别见图1、图2。该设备主要由调压模块、高压脉冲电源模块、空气进出风口及低温等离子体放电电极等部分组成。工作原理：调节调压模块的输出电压（220 V交流电压输入，输出0~24 V直流电压可调），进而改变高压脉冲电源模块的输出电压（即施加在等离子体放电电极上的激励电压），驱动电晕放电，产生低温等离子体，对空气中的细菌进行消杀灭活。

图1低温等离子体空气消毒机结构示意图Fig.1 Structural diagram of the low-temperature plasma air disinfector

图2低温等离子体空气消毒机实物图Fig.2 Physical pictures of the low-temperature plasma air disinfector

1.5 自然环境中微生物的杀灭试验根据《消毒技术规范》的要求[5]，分别选择超净工作台（0.5 m3）和密闭有机玻璃腔体（1.05 m3）进行消毒效果的观察。检测了等离子体空气消毒装置在不同工作参数下（循环风量约40 m3/h，电压为11、12、13 kV，消毒时间为5、10、20 min）对自然菌的消毒效果。消毒前和消毒后，均用Tisch安德森六级撞击式空气采样器进行采样，气体流量为28.3 L/min，。采样时间为消毒前5 min，消毒后10 min。待作用时间结束将采样平板直接放入37℃培养箱中培养48 h，观察结果，计数生长菌落数。同一条件试验重复3次，每次均分别计算其杀灭率，3次结果的杀灭率均≥90%时，可判为消毒合格。杀灭率与消毒前后空气中含菌量的计算方法如下：

1.6 人工染菌环境中微生物的杀灭试验取试验菌种纯培养物，接种于普通营养肉汤中，37℃条件下,以220 r/min震荡培养15 h备用。记录密闭有机腔体（1.05 m3）的湿温度值，然后将使用的器材一次放入腔体内，关闭门。此后，操作和仪器设备的操纵均在腔体外通过带有密封袖套的窗口或摇控器进行，直至试验结束。每次试验结束后需对柜内微环境和柜外环境进行紫外消毒处理。根据《消毒技术规范》的要求，在体积为1.05 m3的密闭腔体内，用微生物气溶胶喷雾器喷洒金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，在喷菌时需按规定的气体流量及喷雾时间喷雾染菌，边喷雾染菌，边用风扇搅拌。喷雾染菌完毕，继续搅拌5 min，而后静置5 min。试验组：在静置5 min后，检测等离子体空气消毒装置在不同工作参数下（循环风量约40 m3/h，电压为13 kV，消毒时间为0、10、20、30 min）对2种细菌的消毒效果。消毒前和消毒后，用安德森六级撞击式空气采样器进行采样，气体流量为28.3L/min。对照组：在静置5 min后，分别在0、10、20、30 min用安德森六级撞击式空气采样器进行采样，气体流量为28.3 L/min。待作用时间结束将采样平板直接放入37℃培养箱中培养48 h，观察结果，计数生长菌落数。同一条件试验重复3次，每次分别计算其杀灭率，3次结果的杀灭率均≥99.90%时，可判为消毒合格。杀灭率的计算方法见公式（1）和（2），消毒前后空气中含菌量的计算方法见公式（3）。

Nt：空气中细菌的自然 消 亡 率；V0与Vt：分 别 为对照组试验开始前和试验过程中不同时间的空气含菌量；Kt：消毒处理对空气中细菌的杀灭率；V0'与Vt'：分别为试验组消毒处理前和消毒过程中不同时间的空气含菌量。

1.7 统计学处理采用SPSS 23.0统计软件对实验结果进行分析，结果用“均数±标准差”表示，自然菌灭活实验组间统计学差异采用两因素析因设计的方差分析进行比较，人工菌组间统计学差异采用单因素方差分析进行比较，若组间差异具有统计学意义，再分别选择LSD和Dunnett法分析组间两两之间的差异性。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 等离子体空气消毒机对0.5 m3空间自然菌的灭活效果在室内温度为24.2~26.4℃，相对湿度为55.8%~65.3% RH的条件下，用低温等离子体空气消毒机对0.5 m3空间内自然菌进行灭活研究，结果显示，不同处理电压和不同处理时间等离子体对自然菌的杀灭率差异有统计学意义，并且2个处理因素间存在交互效应，简单效应分析结果见图3。结合消毒水平，可认为有效抗菌水平的最低处理参数为13 kV电压下处理5 min或12 kV电压下处理10 min，在此条件下等离子体对自然菌的杀灭率分别为（91.23±0.79）%、（91.66±1.43）%。

图3 等离子体空气消毒机对0.5 m3空间自然菌的灭活效果Fig.3 Inactivation effect of the plasma air disinfector on natural bacteria in 0.5 m3 space

2.2 等离子体空气消毒机对1.05 m3空间自然菌的灭活效果在室内温度为23.5~26.3℃，相对湿度为52.2%~64.6%RH的条件下，用低温等离子体空气消毒机对1.05 m3空间内自然菌进行灭活研究，结果表明，不同处理时间和不同处理电压下等离子体对自然菌的杀灭率差异有统计学意义，且2个处理因素间存在交互效应，简单效应分析结果见图4。结合消毒水平，可认为有效抗菌水平的最低处理参数为13 kV电压下处理5 min或12 kV电压下处理10 min，在此条件下等离子体对自然菌的杀灭率分别为（94.58±0.62）%、（93.48±0.78）%。

图4 等离子体空气消毒机对1.05 m3空间自然菌的灭活效果Fig.4 Inactivation effect of the plasma air disinfector on nat⁃ural bacteria in 1.05 m3 space

2.3 等离子体空气消毒机灭活自然菌的代表性菌落与对照组培养皿中含有较多菌落相比，随着等离子体处理时间的延长，菌落数逐渐减少，20 min时已看不到菌落，满足消毒规范要求（≥90%）。该实验过程中的代表性培养菌落分别见图5、图6。

图5 0.5 m3空间内，13 kV电压下不同处理时间的典型菌落Fig.5 In 0.5 m3 space,typical colony of different treatment time under 13 kV voltage

图6 1.05 m3空间内，13 kV电压下不同处理时间的典型菌落Fig.6 In 1.05 m3 space,typical colony of different treatment time under 13 kV voltage

2.4 等离子体空气消毒机对1.05 m3空间人工菌的灭活效果在温度为22.5~26.3℃，相对湿度为52.4%~65.2% RH的条件下，用低温等离子体空气消毒机对1.05 m3空间内人工菌进行灭活研究，结果表明，在13 kV放电电压下，当处理时间为0、10、20、30 min时，等离子体空气消毒机对大肠杆菌的杀灭率分别为0、（95.32±2.18）%、100%、100%；自然消亡率分别为0、（42.49%±8.35）%、（56.29±1.68）%、（66.16±4.36）%；对金黄色葡萄球菌的杀灭率分别为0、(92.95±1.69)%、(99.98±0.01)%、100%；自然消亡率分别为0、（11.60%±1.70）%、（24.58%±4.04）%、（56.27%±4.11）%。与处理前的杀灭率相比，差异均具有统计学意义（P＜0.000 1）。结合平板计数结果，认为两种细菌13 kV电压下处理20 min均可达到消毒规范要求（≥99.9%），见图7。

2.5 等离子体空气消毒机灭活1.05 m3空间人工菌代表性菌落图与对照组培养皿中含有较多菌落相比，随着等离子体处理时间的延长，两种喷雾染菌的菌落数均逐渐减少，当处理30 min时显示无菌落，满足消毒规范要求（≥99.9%）。该实验过程中的代表性菌落见图8、图9。

图7低温等离子体空气消毒机对人工染菌的灭活效果Fig.7 Inactivation effect of the low-temperature plasma air sterilizer on artificially infected bacteria

3 讨 论

低温等离子体是一种结合物理、化学和生物医学的新型技术，已被广泛应用于污水处理、材料改性、消毒灭菌、伤口愈合和肿瘤治疗等多个领域。在物理学上，等离子体被定义为物质存在的第四态，它是一种部分或完全电离的气体。通常等离子体在强电场作用下产生，等离子体中含有大量的高能带电粒子和活性粒子，产生等离子体的同时会产生热辐射和发射出紫外线[6]。在其复杂的成分中，紫外线辐射与活性氧和氮物种(RONS)的作用被认为是在诱导细胞死亡的过程中起主要作用。紫外线可以破坏核酸，而RONS可以氧化核酸、蛋白质和脂质。这些物理和化学因子都能对微生物产生有效的破坏作用，因此，等离子体用于消毒时可认为是多种物理化学因子共同作用，是一种“鸡尾酒”式的综合消毒技术。

低温等离子体用于杀灭微生物的研究开始于20世纪60年代，美国人首先发现，用高频电场激发的卤素气体产生的等离子体可以杀灭多种细菌[7]。近年来，国内外有关等离子体对微生物的杀灭作用的研究取得了很大的进展，然而不同方法（等离子体发生器、电压、工作气体、温度、湿度等因素）产生的低温等离子体成分不一，同种成分的浓度也可能不一，杀菌效果存在差别。因此，对不同方法产生的低温等离子体进行灭菌参数和灭菌动力学的深入研究很有必要。本研究应用的等离子体空气消毒机，以空气作为放电气体，其作用原理是室内空气从进风口进入风道，通过风道后经过等离子体消毒模块阵列，将空气中的病原体杀灭，最后通过排风口排出即为纯净的空气。试验表明，该空气消毒机对自然菌以及人工菌均有明显的杀灭效果，在13 kV工作电压下，对2种人工喷洒菌种，处理20 min，杀灭率均可达到99.9%；对于自然菌，处理5 min，即可达到消毒规范要求的合格标准（≥90%）。相比于目前常用的物理消毒方法(层流净化、紫外线消毒、光催化、高压静电吸附消毒等)、化学消毒方法(臭氧、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、酸性氧化电位水等)及中药消毒方法(艾叶和苍术)[8]的消毒效果和应用限制，本研究所用装置的优点是制造成本低廉、使用便捷、操作简单、杀菌效果可靠、快速、低温、无毒性残留，可在有人环境中实现持续动态消毒灭菌。

图8不同处理时间下金黄色葡萄球菌典型菌落Fig.8 Typical colony of Staphylococcus aureus under different treatment time

迄今为止，有关低温等离子体杀菌的报道已有很多，但由于等离子体成分和生物响应的复杂性，其对微生物的杀菌机制至今尚未有统一定论，根据大多数学者的研究报道，其杀菌机制主要包括细胞产生的生物学响应和低温等离子体产生的物理作用[9]，低温等离子体作用于细菌时，细胞的不同组分如细胞壁、细胞膜、细胞器、核酸等会作出不同的生物学响应，其中细胞膜受损学说、生物大分子损伤学说和细胞亚致死学说是目前普遍解释的生物学方面的机制。物理学机制主要是由等离子体产生的活性基团、带电粒子与电场、紫外线对微生物细胞膜和生物大分子的损伤作用，最终达到灭活微生物的效果。也有很多学者经临床实践研究表明，等离子体杀灭细菌的作用机制可能是由于以上多种原因共同作用。总之，等离子体杀菌的效果与放电参数、气体种类和微生物种类等因素相关。一般认为放电参数越高，产生的等离子体中活性物质的剂量越大，杀灭微生物的效果也越好。本研究团队早期一直致力于研究等离子体对细菌的杀灭作用及机制研究，大量的试验数据表明，带电粒子和ROS在灭活细菌的过程中起主要作用[10-11]。

本研究所用等离子体消毒机以空气作为微生物传播媒介进行灭活效果的研究，以便更清晰地了解空气放电等离子体的灭菌过程，从而实现利用最廉价的空气作为等离子体放电气体奠定基础。

4 结 论

低温等离子体空气消毒机对小空间内自然环境中和人工染菌环境中的微生物均有明显的灭活效果，达到了《消毒技术规范》规定的消毒标准,并且该消毒机工作/小时散发的臭氧平均浓度较低(74.2 μg/m3)，符合国标GB 3095-2012《环境空气质量标准》关于臭氧1 h平均浓度的限值(160 μg/m3)，可满足人类健康安全的需求。