三维细胞培养在膀胱癌中的研究进展

张 涛 张开能 柯昌兴

2020年全球膀胱癌新发人数超过57万，约占新发肿瘤人数的3.0%，死亡人数超过21万，占比为2.1%[1]。淋巴转移是膀胱癌最常见的转移途径，且最常转移至盆腔淋巴结。合并淋巴结转移时，患者5年生存率可明显减低至25%～35%[2]。患者接受手术治疗可在一定程度改善预后，但患者术后5年生存率仍较低，细胞培养在了解膀胱癌的发生、发展机制中发挥着重要的作用，其中三维细胞培养能较好地模拟肿瘤细胞生长的真实情况。

一、三维细胞培养与肿瘤

细胞培养是药物发现、肿瘤研究及干细胞研究中重要且必要的过程，该技术在研究肿瘤生物学行为和分子调控行为中具有重要的作用[3]。既往研究表明，二维细胞培养模式是培养细胞的主要方法，在研究中起着至关重要的作用，但由于二维细胞培养模式在体外不能准确地代表组织细胞及不能较好地模拟肿瘤微环境，存在较多的局限性[4]。三维细胞培养在更好地模拟并复制体内细胞生物学中展示出独特的优势(如增加肿瘤细胞和微环境之间的相互作用)。近年来，三维细胞培养发展迅猛，其关键目标之一是再现人体细胞的空间组织结构和功能。在进行三维细胞培养时，可以对细胞环境进行调控，从而模拟体内的细胞环境。与此同时，三维培养能很好地模拟肿瘤细胞生长的真实情况，对于研究肿瘤微环境、肿瘤细胞生物学行为及抗肿瘤药物筛选等方面具有重要意义[5,6]。因此，三维细胞培养有望最终弥补二维细胞培养模型与动物模型之间的差距。

二、三维细胞培养与膀胱癌肿瘤微环境

从膀胱癌发生到开始转移的过程中，肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)起着至关重要的作用，TME由肿瘤细胞与周围环境基质成分之间密切的相互作用形成，复杂多变，其复杂性在于肿瘤和基质细胞之间的相互作用，而两者间的相互作用可通过各种机制参与膀胱癌的发生、发展和免疫抑制等过程[7,8]。然而，在开发体外模型时，典型肿瘤微环境的成分往往被忽视。肿瘤微环境的细胞(如巨噬细胞、内皮细胞或与癌症相关的成纤维细胞等)参与肿瘤细胞的增殖和迁移，其中炎性细胞通过多因素协同作用形成了TME中免疫调节的特有方式，使得肿瘤细胞能逃逸免疫监视，进而发生转移。常规的二维细胞模型受限于单层形态，无法重现体内肿瘤细胞的特性及复杂的肿瘤微环境，并且细胞与细胞及细胞外基质之间的信号传递大大衰减，导致无法提供确切有效的信号信息[9,10]。

非细胞成分包括细胞外基质(如胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，并以多种形式存在)和各种细胞因子(如生长因子、干扰素、肿瘤坏死因子等)，在肿瘤血管的生成、细胞增殖、远处转移等方面也起着重要的作用。通过建立体外膀胱癌研究模型，可用于观察其发生、发展、转移及耐药机制，为膀胱癌的治疗找到新的治疗方法及靶点。与此同时，三维培养系统还可与多种基质和细胞成分结合，许多不同类型的细胞(如肿瘤相关的巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等)可以整合在三维培养模型中，产生的共培养能够进一步阐明肿瘤细胞与其他类型细胞及细胞外基质之间的信号传递。因此建立三维细胞共培养模型是研究TME的有效手段，其较好地模拟了体内肿瘤细胞生长的微环境，能更好地模拟体内肿瘤细胞生物学行为。研究表明，三维细胞培养能够更好地再现膀胱癌发生浸润的微环境，从非侵袭性肿瘤发展为侵袭性肿瘤的过程中，膀胱癌细胞必须穿透基膜并穿过Ⅰ型胶原蛋白。Ⅰ型胶原蛋白现已被用作构建三维细胞模型的常用基质，其模拟细胞外基质的效果优于二维培养，并且膀胱癌细胞在三维培养中细胞排列更加紧密和自然，因此三维细胞培养能更好地模拟膀胱癌细胞在体内的肿瘤微环境，对于研究膀胱癌的发病机制具有重要作用[11]。

三、三维细胞培养与膀胱癌生物学行为

膀胱癌的发生、发展和侵袭转移受多因素影响，是一个复杂的病理生理过程。相关研究进一步揭示了在三维培养条件下，除了膀胱癌的血管生成能力增强外，其侵袭、迁徙和增殖能力均有增强[12]。三维培养条件下膀胱癌T24细胞的侵袭能力较二维细胞培养明显增强，其主要原因可能是因为在三维培养条件中Eph A2、MMPs及E-cadherin的表达上调，提高了其黏附和侵袭的能力[13]。肿瘤的能量代谢与肿瘤的发生、发展密不可分，在膀胱肿瘤的三维培养技术中，其线粒体能量代谢增强[14]。膀胱肿瘤细胞的能量代谢并不完全符合“Warburg效应”，即使在充足的氧气条件下，仍会发生糖酵解(膀胱癌细胞具有有效的氧化磷酸化过程，可促进相邻间质细胞中的糖酵解)，导致营养前体增加，这些高能代谢产物沿指定方向转移到相邻的肿瘤细胞中，并进入三羧酸循环，最终氧化磷酸化增加，产生足够的ATP以满足需要。Kim等[15]利用三维生物打印机制作了膀胱癌细胞的三维支架，比较膀胱癌细胞分别在三维和二维培养条件中的存活情况，结果显示，三维培养能更为准确地模拟癌细胞在体内增殖的情况，且增殖程度高于二维。三维细胞培养模型还能显示出与细胞间的相互作用，且与体内环境中各细胞间相互作用相似。因此，三维细胞培养能更好地知晓膀胱癌细胞的生物学行为。

四、三维细胞培养与抗膀胱癌药物筛选

药物是治疗肿瘤的重要手段之一。抗癌药物筛选始于二维细胞培养，二维细胞培养测试成功后转向动物模型测试和临床试验，约 90% 在二维细胞模型中被证明有效的药物，在临床试验中失败，仅约10%通过二维细胞培养测试的药物可成功用于临床研发和加工，所以二维细胞培养在筛选抗癌药物中造成巨额研发资金的损失[7,16]。二维培养条件下组织结构和细胞间的相互作用缺失，不能真实地反映体内的情况，而三维细胞培养能模仿细胞的真实生长状态，基因表达更接近体内，被认为更适用于药物筛选[17～20]。

卡介苗是目前治疗膀胱癌患者常用药物之一，大约30%～50%接受卡介苗治疗的患者在治疗的前5年内没有反应，且不良反应明显，使其在临床中的应用受到限制[21]。而卡介苗却在二维细胞培养模型中显示出很好的疗效，与实际临床结果并不相符。Kim等[15]研究认为，在比较两种细胞培养方式对于药物的作用时，应首先确认分泌抗肿瘤细胞因子(IL-6、IL-12及IFN-γ等)的总量，因其能直接影响抗肿瘤作用；在使用卡介苗处理时，二维模型中分泌了更多的抗肿瘤细胞因子，从而增加了在治疗膀胱肿瘤中的抗肿瘤作用，导致二维模型在抗肿瘤作用中的效果被夸大。相反，越来越多的研究表明，三维细胞模型相较于二维细胞模型显示出更高的耐药性，能更加真实地反映患者体内对抗肿瘤药物的特性，进一步说明三维细胞培养更适合于体内模型[22]。

上皮-间充质转化是上皮细胞失去细胞间相互作用而变为活动性和侵袭性的过程，细胞间相互作用可能导致细胞系生长和药物作用之间的差异，上皮-间充质转化过程中表达的钙黏蛋白存在于细胞膜中，当存在两个不同细胞的细胞膜中的钙黏蛋白结合时，就会诱导细胞间的相互作用。E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白是细胞间相互作用的关键标志，E-钙黏蛋白在细胞黏附中起着重要作用，并且在细胞与细胞之间的相互作用中表达最多，N-钙黏蛋白在细胞解离和转移时表达，三维模型中两种钙黏蛋白明显高于二维模型[23]。

转化生长因子-β1是诱导上皮-间充质转化并促进癌症的重要因素，转化生长因子-β1分别处理三维细胞培养和二维细胞培养模型，在二维细胞培养模型中，转化生长因子-β1处理前后E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白之间的差异并不显著。然而，由于强大的细胞间相互作用，在三维细胞培养模型中，转化生长因子-β1处理后的每种钙黏蛋白的含量均存在差异，所以药物的敏感度可因细胞与细胞间的相互作用而发生改变，从而导致药物的渗透性和有效性存在一定差异[15]。因此，构成细胞间相互作用机制的三维细胞模型可能会提供更好的药物测试平台，而且，与二维细胞培养模型评估药物反应所获得的结果相比，三维模型的使用可以获得更准确的结果[24]。此外，三维培养模型还可通过整合人体提供的组织，构建整体器官系统进一步研究，更加准确地预测个人对药物的特殊反应，从而开发个性化药物，改善癌症和其他疾病的治疗。

五、展 望

三维细胞培养方法正处于突破性发展的边缘，与二维细胞培养比较有许多优势，能更好地模拟肿瘤微环境、肿瘤细胞的生物学行为和药物处理时的信号变化情况。但三维细胞培养所用成本较高，且并非所有情况下均能有效地复制细胞微环境，如多数三维细胞培养模型缺少基膜，而基膜是分隔上皮细胞和基质的物理屏障，肿瘤侵袭时会影响肿瘤细胞与基膜之间的动态相互作用，使基膜降解及肿瘤细胞从上皮层迁移，因此，当需要以基膜研究原发性肿瘤的迁移情况时，运用三维细胞培养复制微环境较困难。但随着相关技术的迅猛发展，有望开发出新的方法来克服三维细胞培养目前面临的限制，同时降低其使用成本，从而得到更为广泛的应用，为广大肿瘤患者带来福音。