胆道恶性肿瘤：从临床分型到分子分型

张 瑞， 苏敬博， 张 健， 耿智敏

（西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西 西安 710061）

胆道恶性肿瘤(biliary tract carcinoma,BTC)是起源于胆管及胆囊的恶性肿瘤总称。根据其解剖位置分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)、肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,eCCA)和胆囊癌 (gallbladder cancer,GBC)三类，其中eCCA又包括肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)和远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)。BTC约占所有消化系统肿瘤的3%[1-2]。近年，BTC在全球发病率呈现明显上升趋势，以亚洲国家最为显著[3-5]。由于起病隐匿，侵袭性强，BTC对常规放、化疗不敏感，导致其预后极差，5年生存率仅5%～23%[6-8]。目前BTC常用的分期体系是美国癌症联合委员会 (American Joint Committee on Cancer，AJCC)和国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC) 联合发布的第8版TNM分期系统。该分期全面评估肿瘤局部浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移等临床病理特征。尽管TNM分期有助于判断病人的预后和转归，但由于BTC的高度异质性，对于同一分期的病人，其预后也存在很大差异。因此，目前的TNM分期不能满足精准诊断和治疗的需求，亟需新的分型体系助力BTC的诊治[9]。

肿瘤分型是基于其生长模式和微观特征，从形态学特征、生物学行为和分子机制对肿瘤进行分类。目前的分型方式主要包括临床分型和分子分型。两种分型分别依据肿瘤宏观和微观层面特征进行分类。肿瘤分型对于术前评估可切除性、制定治疗方案、评估预后及指导术后辅助治疗发挥着至关重要的作用。

近年来，对于肿瘤分子生物学机制的研究如火如荼，相关的基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等研究不断深入，推动肿瘤从形态学分型逐渐向分子分型转化。随着国内、外临床多中心研究的开展和高通量测序技术的不断发展，对BTC的生物学特征和分子机制的认识亦不断深入。笔者结合国内、外临床和基础研究进展，系统阐述BTC的临床分型和分子分型，以期为BTC临床精准诊治提供思路与参考。

BTC的临床分型

BTC存在多种临床分型，其中AJCC制定的第8版TNM分期被广泛应用于临床实践中。但该分期存在一定局限性，如未考虑GBC原发部位和生长侵犯方向，一些指标必须等待术中或术后病理诊断，无法在术前进行有效评估及指导治疗方式。因此，亟需引入临床分型系统联合TNM分期来评估肿瘤的可切除性、指导临床决策和评估病人预后。

BTC临床分型应用较多的是pCCA。在pCCA的临床分型中，较为经典的有Bismuth-Corlette分型(B-C分型)[10]和MSKCC T分期[11]。B-C分型是以肿瘤发生的解剖部位及在胆管内生长受累范围为依据，将pCCA分为4型，为手术方式的选择与设计提供重要参考。但该分型未涉及血管浸润、淋巴结转移和肝脏萎缩等影响预后的关键因素，对肿瘤可切除性的判断不准确，对预后预测价值有限。1998年，纪念斯隆-凯特琳癌症中心提出Jarnagin-Blumgart分型[11]。该分型依据术前影像学特征，将门静脉受累和肝叶萎缩纳入分型标准中，主要用于术前评估肿瘤的可切除性。2011年，国际胆管癌协会针对pCCA提出新的分期体系。该体系在综合B-C分型、TNM分期和MSKCC T分期的基础上，纳入剩余肝体积、肝脏基础疾病等因素，用于评估肝切除的安全性，指导手术方式的选择[12]。该分期系统是目前pCCA最全面的评估方式，但其指标内容复杂，所以临床实用性不强。还有基于病理学特征的分期系统，如日本胆道外科学会(Japanese Society of Biliary Surgery，JSBS)分期和Gazzaniga分期系统等。JSBS分期标准与TNM分期类似，但由于其分期标准复杂，限制了临床应用[13]。Gazzaniga分期系统在B-C分型的基础上，根据血管及胆管侵犯的程度进行分期，用于指导手术方案的制定，但尚需大样本临床资料验证，其实用价值有待进一步验证[14]。

日本学者依据iCCA的肿瘤生长模式将其分为3型：①导管内生长型，其表现为管腔内呈息肉状或乳头状生长，较为少见；②导管周围浸润型，即肿瘤沿着胆管或周围血管(如门静脉)蔓延生长；③肿块型，其表现为肝实质中质硬肿块，该型最多见[15-16]。此3种分型可单独出现，也可同时出现。有研究表明该临床分型与TNM分期密切相关，有助于指导治疗和判断预后[17]。

GBC目前没有确定的临床分型。中华医学会外科学分会胆道外科学组根据GBC肿瘤起源部位及侵犯方向，建议分为腹腔型、肝脏型、肝门型和混合型。初步研究发现该4种分型与TNM分期、恶性生物学行为及预后存在明显相关性，对术前评估、手术方案制定及预后评估具有一定指导意义[18]。针对GBC临床分型的一项前瞻性多中心研究目前正在进行，期待最终结果为GBC的临床分型提供循证医学证据。

准确的临床分型，一方面有助于评估肿瘤的可切除性，指导合理选择手术方式；另一方面可指导辅助治疗方案的选择和评估预后转归。近年来随着国际和国内多中心临床研究的开展，BTC临床分型有望出现高级别循证医学证据。研究者通过大样本、高质量、广维度、多层次的数据发现更精准的临床分型，从而指导临床治疗。

BTC的分子分型

BTC因其解剖位置、组织学形态和生物学行为的差异，存在显著的肿瘤异质性。甚至同一病理类型、同一临床分期的病人，其预后及治疗应答效果存在很大差异。因此亟需新的分型方法，准确地反映肿瘤在发生、发展各个阶段的生物学特征，并准确预测其生物学行为，指导临床实践。分子分型是依据分子特征对肿瘤进行分类，部分肿瘤(乳腺癌和结肠癌)的相关研究已取得重大突破，为BTC分子分型提供可借鉴的模板。分子分型不仅可以了解肿瘤的发生机制，准确地评估预后，还可以指导研发新型靶向药物，实现肿瘤的精准化和个体化治疗。近年，随着对肿瘤发生、发展机制的研究日益深入，以及新一代的组学技术飞速发展，BTC的分子分型有望成为可能。

一、基于基因组学的分子分型

以第二代测序为代表的测序技术发展，为全面描绘BTC基因突变图谱提供有力工具，也极大地推动BTC分子生物学机制的研究。BTC发生、发展过程中存在多种突变类型，如肿瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)、富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的结构域1A/B、张力蛋白同源第10染色体丢失的磷酸酶基因失活突变，以及异柠檬酸脱氢酶1/2(isocitric acid dehydrogenase 1/2,IDH1/2)、鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α的功能增益突变[19]。已有多项研究证实，胆道系统中不同解剖部位肿瘤的基因突变谱存在明显差异，为BTC的分子分型奠定一定的理论基础[20-21]。Javle等[22]通过研究BTC(包括85例GBC、57例eCCA和412例iCCA)基因突变模式，评估基因突变与临床特征间的相关性，发现TP53和KRAS突变的病人生存率较低，而成纤维生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)融合的iCCA病人预后较好。这些结果提示依据基因突变类型对病人进行分子分型具有可行性。最近MSKIMPACT NGS平台运用410个基因的panel对BTC进行测序，进一步验证先前Javle的研究结果[22]，发现近一半病人具有潜在治疗意义的突变位点。此项前瞻性研究为BTC的分子分型奠定了基础，并证实通过分子分型来指导晚期BTC病人的靶向治疗具有良好的发展前景。Nepal等[23]研究分析了496例iCCA的基因组数据，根据3个高频突变基因(IDH、KRAS、TP53)的突变状况对病人进行分层，发现每个亚组具有独特的突变特征、共突变谱、富集通路和化疗药物敏感程度。该研究揭示单个基因突变诱导大量下游分子异质性的潜力，同时该分子分型有助于预测iCCA的治疗敏感性。这些基于基因组的分子分型初步揭示BTC的分子特征，具有潜在的临床指导意义。

二、基于转录组学的分子分型

转录组数据以转录序列为核心，弥补基因组由于数据量过大而完整信息对生物性质指导意义过小的缺点，可进一步提高研究的实用价值。根据肿瘤基因表达谱的差异实施分型，是目前分子分型研究的主体，如今已广泛用于乳腺癌[24]、肝癌[25]、结肠直肠癌[26]和胰腺癌[27]的分子分型。在2013年，Sia等[28]根据表达差异将iCCA分为炎症型和增殖型，两组具有不同的激活基因和临床特征。这种分组的可靠性在后续研究中也得到验证[29]。此种分型有助于判断病人预后，为BTC提供潜在的治疗靶点。Ahn等[30]通过对iCCA的转录组和相应临床病理信息整合分析，将病人分为A和B两个亚类。A亚类(预后较好)具有丰富的肝脏相关特征，包含IDH1突变、FGFR2融合，且对吉西他滨敏感。B亚类(预后差)有丰富的炎症相关通路，且TP53、KRAS突变频率更高。该研究阐明分子分型与临床特征的相关性，并评估不同分子亚型对于化疗药物的敏感性。一项国际多中心研究将eCCA分为4种亚型[31]，分别为代谢型(19%)、增殖型(23%)、间充质型(47%)和免疫型(11%)。代谢型主要表现为肝细胞表型，具有转录因子HNF4A和与胆汁酸代谢相关富集通路基因的激活。增殖型在dCCA中更常见，其特征是骨髓细胞瘤病毒癌基因 (myelocytomatosis viral oncogene,MYC)靶标丰富，人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)突变/扩增和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号激活。间充质型表现为上皮-间质转化，同时存在异常的转化生长因子 β (transforming growth factor-β,TGF-β) 信号转导，该类型病人预后较差。免疫型具有更多的淋巴细胞浸润，并伴有细胞程序性死亡受体1/细胞程序性死亡受体-配体1的过表达，提示此类病人对免疫治疗敏感。该分子分型初步确定eCCA的不同分子亚类，为免疫治疗决策和新型靶向药物的研发提供理论依据。

三、基于蛋白质组学的分子分型

蛋白质组学可用于识别和量化肿瘤发生、发展过程中发挥功能的蛋白质，有助于探索肿瘤生物学行为及癌变发生机制。在BTC中，肿瘤衍生蛋白质可通过肿瘤细胞的坏死和凋亡释放到胆汁中，在癌变过程中实时提供有用信息。已有多项研究通过鉴定胆汁中的蛋白质组成分，挖掘出潜在的生物标志物，给基于蛋白质组学的分子分型提供重要依据[32-33]。除此之外，Darby等[34]应用荧光凝胶电泳和串联质谱相结合的方法，比较BTC组织和癌旁组织的蛋白质组信息，发现约138种蛋白质的表达存在差异。这类差异蛋白质表达分型将有助于指导病人靶向治疗。类似的研究还有许多。Yu等[35]通过挖掘蛋白质组学信息，发现丙糖磷酸异构酶1(triose-phosphate isomerase 1,TPI1)表达水平与iCCA复发率显著相关，并据此建立相关列线图预测模型，可准确预测iCCA切除后的复发。Chang等[36]研究分析iCCA病人血浆中5 320种蛋白质含量，最后确定25个候选生物标志物。该研究揭示在不同肿瘤发展阶段的蛋白质组表达模式，并筛选出更有效的血清标志物，对于预测肿瘤复发和病人生存具有一定的临床价值。尽管目前并没有蛋白质组学系统用于BTC分型，但随着蛋白质组学研究的不断深入，基于蛋白质组学的BTC分子分型也将展示出良好的诊断及治疗指导作用。

四、基于代谢组学的分子分型

胆道系统与胆汁的生成及排泄密切相关，在脂肪代谢、胆汁酸代谢和电解质代谢等过程中发挥关键作用。BTC病人常伴有梗阻性黄疸，出现肠肝循环的紊乱，以及不同程度的代谢功能紊乱。因此，对BTC病人癌组织、血清及胆汁进行代谢组学分析有助于BTC的诊断和预后评估。西班牙学者应用质谱和超高效液相色谱对恶性胆道狭窄病人的胆汁进行代谢组学研究[37]，同时利用神经网络算法确定了由10种脂质和5种蛋白质组成的检测组合，并以此来鉴别良性与恶性胆道狭窄。Liang等[38]综合分析BTC病人与正常人血样中的血清代谢物，鉴定出75种代谢物含量在两类人群中存在明显差异。与正常人组相比，BTC病人的21脱氧皮质醇和胆红素水平显著增加，而溶血磷脂酰胆碱水平显著降低。该研究团队还发现这3种代谢物水平不仅可辨别BTC，还可区分eCCA和iCCA。尽管基于代谢组学的鉴别诊断具有高准确性，但由于肿瘤相关代谢物种类繁杂，且代谢物检测的成本高，基于代谢组学的分型尚处于起步阶段，需进一步研究证实。

五、基于肿瘤微环境的分子分型

肿瘤微环境 (tumor microenvironment，TME)与肿瘤的发生、发展过程密切相关。近年，免疫检测点抑制剂作为实体肿瘤的一线或二线治疗方案，改变了传统癌症治疗策略。但免疫疗法在BTC的应用仍存在很多难题，如肿瘤异质性大、免疫应答率较低和缺乏有效的疗效评价指标等[39]。因此，依据TME免疫特征对BTC分型有助于指导免疫治疗决策。可通过分子分型筛选出免疫治疗敏感型的病人，使这类病人从免疫治疗中获益。Job等[40]定量分析566例iCCA的TME中免疫细胞群体，根据免疫反应和信号特征 (肝脏活性、炎症和免疫抵抗)，将iCCA分为4种免疫亚型：①免疫沙漠型；②免疫原性型，其特征是大量先天性和适应性免疫细胞，以及激活的炎症和免疫检测点途径；③富含髓样蛋白型，以单核细胞衍生的髓样蛋白高表达为特征；④间充质型。其中免疫原性型病人作为潜在的免疫治疗敏感人群，有望从免疫抑制剂治疗中获益。肿瘤免疫浸润细胞在BTC的发生、发展过程中发挥重要作用，对于预测肿瘤转移有一定的临床实用价值。有学者证明晚期局部进展型BTC病人肿瘤组织中CD8+淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞的浸润明显多于远处转移型病人[41]。该研究提示，对微环境中免疫细胞的分析有助于判断肿瘤的进展情况。

六、基于多组学联合的整合聚类

早期的聚类为单一聚类，其仅依靠基因组或转录组进行分型，而多组学联合分析能全面地阐释肿瘤分子特征。2015年，Nakamura等[21]对全外显子和转录组数据进行无监督聚类分析，将BTC分为4种亚型：1型 (大多数为eCCA)，主要特征是RAS和MAPK激活信号显著下调；2型存在高频率突变基因包括 TP53和KRAS；3型存在高频率的 BAP1、IDH1、NRAS突变和FGFR2融合；4型表现为大量的高频率突变肿瘤特异性抗原，免疫系统成分表达明显升高，预后最差，提示4型病人为免疫治疗的潜在人群。近期一项国际多中心研究分析GBC整合基因组、表观遗传组、转录组数据，发现与生存相关的3种分子亚型[42]。其中2型预后相对较好，1型和3型预后较差。这两种预后较差的亚型与不良的临床病理特征、免疫抑制微环境(髓源性抑制细胞积聚和广泛的结缔组织增生、缺氧)和T细胞功能障碍相关。该研究提示1型和3型病人有望从免疫治疗中获益。对于免疫耐受的2型病人，则推荐使用MAPK或TGF-β靶向药物。这项研究表明，TME的特征在GBC的发生、发展中发挥重要作用，对其突变特征进行评估，有利于预后判断和指导靶向治疗。Jusakul等[43]对来自10个国家的489例BTC的全基因组、靶向/外显子组、拷贝数、转录组和DNA甲基化数据进行分析，综合聚类将其分为4种亚型：①具有启动子CpG岛的甲基化，ARID1A和乳腺癌易感基因突变的富集以及高水平的非同义突变；②表现出β连接蛋白1、Wnt家族成员 5B(Wnt family member 5B，Wnt5B)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)表达上调；③表现出与免疫检测点抑制和T细胞信号转导相关途径的基因特异性上调；④存在IDH1/2突变，FGFR2融合和乳腺癌易感基因相关蛋白质1突变。值得注意的是，前两类主要由eCCA组成；后两类则由吸虫非相关iCCA组成。在临床上，与1、2型病人相比，3、4型病人的预后更好。该项研究确定了新的驱动基因、非编码启动子突变和结构变异。基于整合聚类的分子亚型不仅指出不同亚型之间的分子生物学差异，还提供不同亚型病人潜在的治疗靶点信息，有助于实现精准治疗。

结 语

目前肿瘤的治疗模式，正向着规范化、个体化的循证医学方向发展。新的分型体系不仅与临床病理信息紧密结合，而且反映分子水平变化。精准的BTC分型不仅有助于指导手术方案的选择，还可辅助预后转归的判断，将极大加深临床医师对肿瘤生物学本质的理解，以便制定精准化、个体化的治疗策略。目前关于BTC的临床分型和分子分型暂无完全成熟的标准，不同分型方案各有侧重。随着高通量测序和医学人工智能等技术的飞速发展，BTC的分型必将越来越接近肿瘤生物学特征的本质，从而准确地指导诊断与治疗，最终提高病人生存率。相信在不远的将来，基于临床分型和分子分型，更安全、有效的BTC个体化精准治疗模式将会越来越多地应用于临床。