毛竹冬笋生长发育过程淀粉空间变化规律1)

张佳佳 马瑞乡 丁兴萃 修诚明 黄满昌

(国家林业和草原局竹子研究开发中心，杭州，310012)

可溶性糖和淀粉合称为非结构性碳水化合物(NSC)，是植物营养组织中储存碳水化合物的主要形式[1]，在植物的生长发育、能量供应中具有重要的意义[2-3]。NSC的组分存在不同的功能，其中可溶性糖用于植物即时功能，如呼吸、渗透调节等；淀粉则贮存在体内以备植物未来利用，两者间存在着平衡、循环[4-5]。淀粉由直链淀粉及支链淀粉组成，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase，淀粉合成限速酶)、颗粒结合淀粉合成酶(GBSS，参与直链淀粉合成)、淀粉分支酶(SBE，参与支链淀粉合成)等参与淀粉合成[6-8]。在植物体内，可溶性糖质量分数量低时，淀粉通过水解酶(主要为α淀粉酶、β淀粉酶)转为单糖，提供生长发育所需的能量[9-10]。淀粉在维持植物正常生理功能方面发挥重要作用。

毛竹(Phyllostachysheterocycla)，为禾本科竹亚科刚竹属，是1种大型的笋材两用散生竹，也是我国竹类资源中数量最多、分布范围广、价值高的竹种[11]。毛竹的地上竹杆通过地下竹鞭形成1个地上-地下紧密联通系统。夏末秋初，毛竹地下壮龄鞭的侧芽发育，于冬季进入休眠的芽称为毛竹冬笋。来年春天，气候适宜，冬笋打破休眠破土而出，进行快速生长发育成竹，日生长高达1.2 m，为世界上生长速度最快植物之一[12]。研究表明，竹子快速生长源于其自下而上的各个节上存在分生组织结构，通过细胞分裂、伸长完成快速生长[13-15]，非结构性碳水化合物参与其快速生长[16-17]。在毛竹快速生长过程中，生长促进类激素与生长素、分裂素与生长抑制类激素(细胞脱落酸)比值远高于一般植物[18]。Cui et al.[12]提出，毛竹笋在几乎无光合能力的快速生长阶段能量主要衍生于蔗糖降解。关于竹子快速生长所需的NSC及NSC如何储存、分配的研究较少，该问题已成为目前竹林培育技术的1个关键性、基础性问题。Song et al.[19]提出,成熟毛竹的枝、叶、杆、鞭通过地下茎运输同化物到新笋芽上(毛竹春笋)，以供应新笋的生长发育，直到新笋长成新竹后进行光合作用，从而实现营养自足。竹林培育研究普遍认为竹子类似马铃薯等块茎植物，NSC主要储存于竹鞭，但是该结论机理不清，缺乏科学依据。鉴于植物的淀粉代谢酶受环境影响尤为显著[20-21]，本研究首次选择2个差异明显的气候区—北亚热带气候区，中、南亚热带气候过渡区的毛竹冬笋及其连接的竹鞭为研究对象，通过平行试验，观察毛竹笋淀粉形态结构及分布，比较毛竹冬笋不同部位及其竹鞭的可溶性糖(葡萄糖、果糖、蔗糖)、淀粉、淀粉关键代谢酶活性的差异，研究毛竹冬笋生长发育过程淀粉空间变化规律，探究NSC储存、分配与竹笋生长发育关系，为创新毛竹笋、材定向高效培育提供参考。

1 研究区概况

试验地位于福建省华安县(25°5′N,117°31′E)、浙江省湖州市吴兴区(30°48′N,119°59′E)。华安县属中亚热带及南亚热带气候过渡区，全年气候温和多雨，光照充足。吴兴区属北亚热带气候区，四季分明，雨热同季。2个毛竹笋生长地区的月温度情况如图1，数据来源于中国气象数据网(http://data.cma.cn)。

图1 2个生长地区的月温度及降水情况

2 材料与方法

2.1 试验材料

毛竹笋采自2020年1月，随机选取3年生母竹孕育的毛竹冬笋各3株(无损伤、大小相似，并且从螺丝钉部位取下)，收集与竹笋连接的竹鞭。将毛竹笋按长度均等分为上部、中部、基部3个部分。在毛竹笋上部的基面，中、基部的中部进行取样，每个部位各取1 cm3大小的笋块，放入固定液中，经过真空抽气后常温保存，用于组织解剖观察。剩余的笋样、竹鞭经液氮速冻后，带回实验室，放于-80 ℃冰箱保存，用于可溶性糖、淀粉、淀粉代谢酶活性的测定。

2.2 试验方法

2.2.1 组织结构观察

上、中、基部的笋块经过甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定，用梯度酒精进行脱水，二甲苯透明，常规石蜡切片法制作后，在旋转切片机上连续切厚约6 μm的横切片。经高碘酸锡夫反应(PAS)染色[22]，二甲苯透明，中性树胶封片后，在NIKON Eclipse CI显微镜下观察拍照。

毛竹笋顶部笋块通过戊二醛固定后，经过双固定、脱水、渗透、包埋、染色、切片等步骤，在Hitachi H-7650型透射电镜下观察淀粉粒形态。

2.2.2 葡萄糖、果糖、蔗糖质量分数测定

根据高效液相色谱(HPLC)法[23]进行蔗糖、果糖、葡萄糖测定。取0.5 g新鲜样品，加入10 mL体积分数为80%乙醇，在80 ℃下提取40 min，再经过11 000×g离心5 min，该步骤重复3次。混合上清液后，在沸水浴中蒸发乙醇。将5 mL蒸馏水加入残留物中，形成悬浊液，即为蔗糖、果糖、葡萄糖的待测液。色谱的参数设置具体如下：流动相为V(乙腈)∶V(水)=70∶30，柱温30 ℃，进样量5 μL，流速设置为1 mL·min-1，蒸发光散射检测器(ELSD)的漂移管温度为85 ℃，流速为2 L·min-1。葡萄糖、果糖、蔗糖的标准品用于定量。

2.2.3 淀粉质量分数的测定

使用直链淀粉、支链淀粉的试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)对直链淀粉、支链淀粉含量进行测定，具体操作按照操作说明书进行。总淀粉质量分数=直链淀粉质量分数+支链淀粉质量分数。

2.2.4 淀粉合成酶的活性测定

根据Nakamura et al.[24]的方法提取淀粉合成酶的粗提液。根据Nakamura et al.[24]、Dai et al.[25]的方式测定腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶的酶活性。根据李太贵等[26]的方法测定淀粉分支酶活性。

2.2.5 淀粉酶的活性测定

使用α淀粉酶、β淀粉酶试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)进行α淀粉酶、β淀粉酶的活性测定。按照Bradford[27]的考马斯亮蓝法进行可溶性蛋白质的测定。上述试验均进行3次生物学重复。

2.3 数据处理

采用SPSS软件对数据进行单因素方差分析及多重比较，利用Origin作图。分别对毛竹冬笋及竹鞭的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉及淀粉的代谢酶进行相关性分析。

3 结果与分析

3.1 毛竹笋淀粉粒的分布

冯建元[28]提出，毛竹笋芽发育分为休眠期、萌动期、发育期、成熟期4个时期。从组织结构来看(图2)，2个地区毛竹笋的维管束从上部到基部明显增大，上部导管小，基部的导管较中、上部发育成熟，后生导管明显增大。不仅如此，基部韧皮部及木质部的细胞壁出现明显增厚的现象，围绕在维管束周边的纤维细胞逐渐紧密排列。总体来说，2个地区毛竹冬笋各部分的组织已经发育完善，此时的毛竹笋处于成熟期阶段，其发育、成熟从基部开始，中、上部稍晚，这与崔凯等[29]关于毛竹秆茎组织空间发育的结论一致。

a1、a2、a3分别为吴兴地区毛竹笋上部、中部、基部的组织结构示意图(×10)；b1、b2、b3分别为华安地区毛竹笋上部、中部、基部的组织结构示意图(×10)；P为薄壁细胞；F为纤维细胞；Ve为导管；V为维管束；S为淀粉粒。

2个地区的毛竹笋淀粉粒分布具有一致性(图2)。薄壁细胞中含有丰富的淀粉粒，其是淀粉粒的贮藏部位；中、上部的淀粉粒数量多于基部；靠近维管束周边的薄壁细胞中淀粉粒较多。在电子显微镜下(图3)，可以清楚观察到淀粉粒靠近细胞膜分布，以椭圆形为主。淀粉体几乎解体，淀粉粒体积大，大部分表面光滑，部分淀粉粒出现了折叠层，此时的淀粉粒处于发育早期[30]。

3.2 毛竹笋不同部位非结构性碳水化合物的差异

2个地区毛竹冬笋不同部位的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉质量分数见表1。2个地区的非结构性碳水化合物有所差异，吴兴毛竹笋体内的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉质量分数分别高出华安地区毛竹笋2%、1%、0.1%～0.2%、1.29%左右。2个地区毛竹笋的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉质量分数均在中部最高，其次为上部、基部，均显著高于其连接竹鞭的非结构性碳水化合物质量分数。

a为吴兴地区毛竹笋顶部淀粉粒，b为华安地区毛竹笋顶部淀粉粒；a1、b1为8 000×，a2、b2为25 000×。

表1 不同部位毛竹冬笋的非结构性碳水化合物质量分数 %

直链淀粉、支链淀粉组成了总淀粉。从表2可以看出，2个地区毛竹冬笋均为直链淀粉质量分数低，支链淀粉质量分数高，且竹笋内直链、支链淀粉质量分数显著高于竹鞭。其中，毛竹笋中部的直链、支链淀粉质量分数最高。笋体的支链淀粉质量分数为30%～50%，直链淀粉质量分数为6%～10%，支链淀粉占总淀粉的82%～84%。连接笋体的竹鞭支链淀粉质量分数仅为2.9%～7.9%，占总淀粉的68%～75%，支链淀粉比例显著下降。

表2 不同部位毛竹冬笋的直链、支链淀粉质量分数 %

3.3 毛竹笋不同部位淀粉合成相关酶的变化

2个地区毛竹笋的3种淀粉合成有关酶变化规律一致(表3)。竹笋体内不同部位的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶活性没有显著差异，中、上部活性高于基部；淀粉分支酶活性最高的是中部，吴兴、华安地区分别为11.705、5.602 U·mg-1，其基部淀粉分支酶活性较低；竹鞭的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、淀粉分支酶活性均显著升高，如吴兴地区竹鞭的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性高达311.419 nmol·min-1·mg-1，显著高于笋体(108～125 nmol·min-1·mg-1)，颗粒结合淀粉合成酶、淀粉分支酶也具有相似变化。

表3 毛竹冬笋不同部位淀粉合成相关酶活性

虽然毛竹笋不同部位与竹鞭的淀粉合成相关酶活性变化规律具有一致性，但2个地区的酶活性存在一定差异。吴兴地区的毛竹笋腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性显著高于华安毛竹笋的，且吴兴毛竹鞭腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性(311.419 nmol·min-1·mg-1)几乎为华安毛竹笋竹鞭腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性(161.934 nmol·min-1·mg-1)的2倍。颗粒结合淀粉合成酶活性也具有相似变化规律。华安毛竹笋的中、上部淀粉分支酶活性显著低于吴兴毛竹笋的，但是竹鞭淀粉分支酶活性((16.483±1.263)U·mg-1)显著高于吴兴毛竹鞭。

3.4 毛竹笋不同部位淀粉酶的变化

2个地区毛竹笋不同部位淀粉酶的活性如表4。α淀粉酶、β淀粉酶在2个地区毛竹笋不同部位的变化存在相同规律，即基部α淀粉酶、β淀粉酶活性最高，越往上部，活性逐渐降低。与淀粉合成相关酶一致，竹鞭的淀粉酶活性显著增高。虽然华安毛竹笋的淀粉酶活性低于吴兴毛竹笋，但是其毛竹鞭的α、β淀粉酶活性(0.356、1.030 mg·min-1·mg-1)显著高于吴兴毛竹鞭(0.331、0.791 mg·min-1·mg-1)。

表4 2个地区毛竹冬笋不同部位淀粉酶活性

3.5 淀粉与可溶性糖、淀粉代谢酶的相关性分析

将毛竹笋及竹鞭的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉关键代谢酶、直链淀粉、支链淀粉进行相关性分析，结果如表5。毛竹笋的可溶性糖、淀粉关键代谢酶与直链淀粉、支链淀粉存在显著正相关性。竹鞭的葡萄糖、果糖、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶与直链、支链淀粉存在显著正相关性；淀粉分支酶、α淀粉酶、β淀粉酶与直链、支链淀粉呈显著负相关。

表5 毛竹笋、竹鞭的淀粉与可溶性糖、淀粉代谢酶间的相关性

4 讨论

4.1 毛竹笋及竹鞭淀粉空间分布与竹笋快速生长功能的关系

毛竹地上竹杆和地下竹鞭形成1个封闭的系统进行物质运输，加上其“慢-快-慢”生长规律，能使冬笋打破休眠破土而出后2个月左右生长至20 m左右[12,19]。与毛竹生长规律一样，毛竹笋从基部节间开始遵循着“慢-快-慢”的规律向上进行生长[15]，不同的部位代表不同的发育阶段。本研究发现，冬笋已经形成较成熟的维管束结构(图2)。笋体上部淀粉粒显著多于基部，且淀粉粒主要围绕在维管束周边，笋体上部的可溶性糖、淀粉质量分数也高于基部，更高于竹鞭。植物运输同化物需要借助韧皮部上下两端的膨压差[31]，冬笋积累的NSC形成空间分布格局，既满足冬笋代谢的物质、能量基础，又能维持竹笋上、下部的膨压差，促进竹笋自下而上近距离供应生长发育所需物质能量。

冬笋生长发育所需营养物质由母竹供应。目前为止，竹林培育界认为竹鞭是淀粉等营养物质主要贮藏场所。但3—5年生的竹鞭，纤维细胞壁增厚、体积增大，结构性碳水化合物增多，贮存淀粉的薄壁组织比例降低[32]，细胞间的物质传递速度减缓，水解形成的可溶性糖难以立即满足竹笋快速生长时期对糖分大量、快速的供应要求。因此，我们认为竹笋淀粉粒空间分布与淀粉质量分数的差异，与竹笋生长特点吻合。竹笋是淀粉贮存的主要场所，而竹鞭更多是发挥同化物转运管道功能，将母竹同化物运输到竹笋，这样不仅能保证冬笋的基础代谢，也保障春天竹笋能实现快速生长。冯建元[28]发现毛竹冬笋芽发育中期(基部维管束发育成熟时期)出现淀粉粒积累在笋中的现象；Deng et al.[33]通过定位研究发现，云南箭竹快速生长节上部维管束周边的薄壁细胞蔗糖、葡萄糖、淀粉质量分数及相关酶活性高，利于同化物的运输、卸载，该结论为本研究提供了理论支撑。

4.2 毛竹笋及竹鞭淀粉代谢动态变化与毛竹笋生长发育关系

植物可溶性糖质量分数高时，蔗糖通过水解产生果糖、葡萄糖，在酶的作用下生成淀粉合成的底物(葡萄糖-1-磷酸)，经过腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、淀粉分支酶等作用合成淀粉[34]，以淀粉形式贮存以备使用；在其质量分数低时，通过α淀粉酶、β淀粉酶等断裂糖苷键水解淀粉生成糖，用于满足植物的生长发育需求[9-10]，这是1个动态循环的变化过程。毛竹笋自下而上开始成熟，冬笋上、中部的葡萄糖、果糖、蔗糖质量分数高，一方面满足冬笋细胞分裂能量需求，另一方面，合成淀粉的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、淀粉分支酶活性高，水解酶活性低，促进淀粉积累，为春天快速生长的物质供应做储备。毛竹细胞增厚主要来源于纤维素的沉积，而纤维素的合成底物由单糖供应[16]。冬笋基部出现细胞增厚现象(图2)，其可溶性糖质量分数低于中、上部，淀粉合成相关酶活性也有所降低，但是α淀粉酶、β淀粉酶活性高于中、上部。淀粉质量分数下降，表明毛竹冬笋基部淀粉积累量不仅受限底物水平，还受水解酶的影响，其通过水解淀粉满足毛竹冬笋基部结构形成。整体来说，毛竹冬笋的淀粉质量分数与可溶性糖质量分数、淀粉合成相关酶、淀粉水解酶呈显著正相关，即虽然存在淀粉合成及水解的动态变化，但淀粉合成仍占主导地位。

竹鞭的可溶性糖、淀粉质量分数显著低于笋体各部位。竹鞭淀粉质量分数与可溶性糖质量分数呈显著正相关，其腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、淀粉分支酶活性也显著高于毛竹笋笋体的，几乎为笋体的2倍。竹鞭的α、β淀粉酶活性也显著高于毛竹冬笋，竹鞭淀粉质量分数与淀粉水解酶呈显著负相关，尤其是β淀粉酶，因此当母竹将糖分流动到竹鞭时，当下的高糖水平刺激竹鞭进行了淀粉合成，但合成的淀粉在高活性水解酶作用下，水解形成单糖，仅留部分糖满足自身代谢，将大部分糖转移到笋体，并贮存在笋体内，提供竹笋生长发育物质基础。因此，在形成高活性淀粉合成酶的状态时，可溶性糖、淀粉质量分数低，即竹鞭淀粉合成和水解动态过程中，淀粉水解占主导地位。从毛竹地下鞭侧芽出现后，毛竹鞭的淀粉含量不断下降[35]，本研究结果与其一致。

与毛竹冬笋相比，竹鞭的支链淀粉比例显著下降，参与支链淀粉合成的淀粉分支酶及断裂非还原端的1,4糖苷键的β淀粉酶与竹鞭的淀粉质量分数呈显著负相关。也就说，竹鞭淀粉分支酶活性高，正常能够合成较多支链淀粉，但毛竹鞭中的支链淀粉质量分数下降，这是因为竹鞭的β淀粉酶活性也很高，在合成和水解过程支链淀粉过程中，水解支链淀粉占主导地位，导致支链淀粉质量分数显著下降。支链淀粉质量分数高有助于维持淀粉粒结构[36-37]，进一步表明竹鞭支链淀粉质量分数低，淀粉结构不如毛竹冬笋稳定，易发生水解。

综上所述，本研究提出，毛竹冬笋在生长发育过程可能存在的1个淀粉动态变化情景。在毛竹冬笋发育过程，从母竹流动到新笋芽的糖，刺激竹鞭进行活跃的淀粉合成。但快速水解将大量糖分流动至笋体，通过笋体维管束将糖自下而上运输、卸载在毛竹笋各部位，主要积累在上部维管束周边的薄壁细胞。一方面利用糖的高含量形成笋体上下两端的膨压差，源源不断地从竹鞭运输物质；另一方面，将富余的糖合成淀粉贮存在笋体内，以备近距离供应春天竹笋快速生长发育所需的物质能量。

4.3 环境对毛竹笋淀粉代谢的影响

虽然2个地区毛竹笋、竹鞭的淀粉代谢表现具有一致性，但是华安毛竹冬笋淀粉、可溶性糖质量分数、淀粉代谢酶活性低于吴兴毛竹冬笋的，其竹鞭的淀粉分支酶及水解酶活性高于吴兴毛竹冬笋。这与毛竹冬笋生长环境有关，华安地区月温度明显高于吴兴地区，其降水量在冬笋发育时期低于吴兴地区(图1)。有研究表明，低温利于块茎作物的发育[38]，生长温度升高(15 ℃以上)会降低水稻、玉米的直链淀粉质量分数，减少大麦、小麦、土豆块茎的淀粉粒数量[20,39-40]，玉米、土豆、小麦、缺苞箭竹通过降低淀粉含量和淀粉代谢酶活性来适应干旱环境[41-44]。环境对冬笋淀粉代谢的影响与大麦等作物相似，但生长环境是温度、水分、土壤、人工经营等因素的综合作用。不同地区毛竹冬笋及竹鞭的NSC和淀粉代谢相关酶活性存在的差异主要受何种环境因素影响，这些环境因素对毛竹笋淀粉代谢的作用不能一概而论，需进一步研究。

5 结论

本研究选择北亚热带气候区及中、南亚热带气候过渡区的毛竹冬笋不同部位及其竹鞭NSC质量分数(葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉)和淀粉关键代谢酶活性，发现2个地区的毛竹冬笋淀粉代谢变化规律表现具有一致性。冬笋及竹鞭的淀粉空间分布与其生长发育特点紧密联系，毛竹冬笋淀粉合成占主导地位，其连接的竹鞭淀粉水解占主导地位。淀粉主要贮存在笋体，为春天竹笋快速生长提供能量。此外，生长环境不能改变毛竹冬笋生长发育过程的淀粉变化规律，能影响的仅是淀粉质量分数及淀粉代谢酶活性的高低，但具体影响因素需进一步研究。