铁皮石斛多糖对糖尿病大鼠脂代谢异常的改善作用及机制

2021-12-03寇战利陈社论刘冰林张效科李聪郭杰

广州中医药大学学报 2021年11期

寇战利，陈社论，刘冰林，张效科，李聪，郭杰

（1.咸阳市第一人民医院中医科，陕西咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院内分泌科，陕西咸阳 712083）

随着人们生活方式和饮食方式的改变，2型糖尿病的患病率不断上升。临床已成功研制出许多口服降糖药，如磺酰脲类、噻唑烷二酮类等。虽然这些药物降糖疗效显著，但存在低血糖、过敏反应、胃肠道反应、肝损伤、血液系统不良反应等副作用[1]。目前，寻找疗效好、毒性低的天然抗糖尿病活性成分成为研究的热点。糖尿病属于中医学“消渴”的范畴，基本病机以阴虚为本，燥热为标[2]。铁皮石斛是治疗“消渴”的常用中药，具有生津益胃、滋阴清热的功效[3]。铁皮石斛多糖是铁皮石斛中发挥药理作用的主要活性成分[4]，具有抗疲劳、抗氧化、抗癌、降血糖血脂、免疫调节及肝保护等作用[5-7]。有研究[8-9]表明，铁皮石斛多糖可改善糖尿病小鼠血脂代谢紊乱，修复胰岛细胞，促进胰岛素分泌和肝糖原合成，减轻肾损伤。然而，铁皮石斛多糖降糖降脂作用的潜在机制尚不清楚。基于此，本研究建立糖尿病大鼠模型，观察铁皮石斛多糖对脂代谢异常的改善作用，并探讨其可能的作用机制，以期为临床应用铁皮石斛多糖治疗糖尿病提供新的依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90 只雄性SPF 级6 周龄SD 大鼠，体质量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2019-0002。饲养于陕西中医药大学实验动物中心，保持温度23～25 ℃，湿度60%～65%，昼夜12 h交替环境中，适应性饲养7 d。

1.2 药物、试剂与仪器铁皮石斛多糖（北京索莱宝科技有限公司，纯度≥85%，批号：180316）；盐酸二甲双胍肠溶片（河北医科大学制药厂，国药准字H20083575）。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma 公司）；柠檬酸（天津永大化学试剂有限公司）；兔抗大鼠胰岛素受体底物2（IRS2）、磷酸化IRS2（p-IRS2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）单克隆抗体和蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗体（北京全式金生物技术有限公司）；甘油三酯（TG）、空腹胰岛素（FINS）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒，总胆固醇（TC）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（上海晶抗生物公司）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司）。Multiskan FC全自动酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 建模与分组随机选取75只大鼠建立糖尿病大鼠模型，剩余15 只为正常组。造模方法参照文献[10]：建模大鼠用高糖高脂饲料（质量分数配比：10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料）喂养，正常组大鼠用常规饲料喂养。喂养1个月后，禁食不禁水12 h，建模大鼠给予腹腔注射10 g/L STZ溶液（由0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液冰浴配制，现配现用）30 mg/kg，正常组腹腔注射等体积的0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液。注射后3 h 禁食，给予大鼠30 g/L 葡萄糖溶液预防低血糖。3 d 后，所有大鼠禁食12 h，尾静脉采血测空腹血糖（FBG），若FBG ≥16.7 mmol/L，且维持1 周以上，则判断造模成功[11]。将造模成功的68 只大鼠随机分为模型组，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组，每组17只。

1.4 干预方法造模成功24 h后，依照药理实验中动物与人体间的等效剂量换算，参照芦春斌等[12]的大鼠给药剂量，铁皮石斛多糖低、高剂量组分别灌胃铁皮石斛多糖100、200 mg/kg，二甲双胍组灌胃盐酸二甲双胍150 mg/kg，正常组和模型组灌胃等体积的生理盐水。每日1次，共干预30 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 血FBG、FINS检测尾静脉取血，应用血糖仪测定各组大鼠药物干预0、15、30 d FBG 水平。于药物干预30 d，按照FINS ELISA 试剂盒说明书加样，应用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度（OD）值，绘制标准曲线，计算FINS的浓度。

1.5.2 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平检测末次药物干预结束后，各组随机选取7只大鼠，断头取血，以3 500 r/min，离心半径8 cm，离心10 min，得到上清液，-20 ℃保存备用。取出-20 ℃保存备用的上清液，分别按照TG、TC、LDL-C、HDL-C试剂盒说明书，应用酶标仪检测大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 在500 nm、510 nm、546 nm、546 nm 波长处的OD 值。各生化指标水平=（样本OD 值-空白孔OD 值）/（校准品OD 值-空白孔OD值）×校准品浓度。

1.5.3 血清SOD、MDA水平检测取保存在-20 ℃的上清液，按照SOD 试剂盒说明书加样，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD 水平，应用酶标仪测出550 nm 波长处的OD 值。SOD 样品比活力（U/mL）=（对照管OD值-测定管OD值）/对照管OD值÷50%×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

取保存在-20 ℃的上清液，按照MDA 试剂盒说明书加样，采用硫代巴比妥酸法测定MDA 水平（μmol/L），应用酶标仪测出532 nm 处的OD 值。MDA含量（nmol·mL-1）=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（10 nmol·mL-1）×样本测试前稀释倍数。

1. 5. 4 苏木素-伊红（HE）染色法观察肝脏组织病理学变化将剩余大鼠全部处死，快速从腹腔分离出肝脏组织，用生理盐水清洗后，左侧肝脏组织用40 g/L 多聚甲醛溶液固定24 h，于4 ℃冰箱保存。右侧肝脏组织置于-80 ℃冰箱中保存。将肝脏组织从固定液中取出，梯度乙醇脱水，二甲苯处理，石蜡包埋，切片（4 μm），HE染色，脱水透明，中性树脂胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

1. 5. 5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测肝脏组织IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 蛋白相对表达水平取-80 ℃保存的肝脏组织100 mg，研磨，加入蛋白提取液冰上裂解，离心，取上清，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量；加入十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液，100 ℃水浴使蛋白变性，进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE），转膜；50 g/L脱脂牛奶室温封闭2 h；洗膜后分别加入1∶1 000 稀释的IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、mTOR单克隆一抗和AKT、p-AKT多克隆一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜后加入1∶4 000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；洗膜后加入电化学发光液（ECL）显影。采用ImageJ软件分析图像，以β-actin为内参，IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相对表达量用目的蛋白条带灰度值与β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示。

1.6 统计方法采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠血FBG、FINS 水平比较 FBG、FINS 水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组干预0、15、30 d FBG水平和FINS 水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组干预0 d FBG 水平差异无统计学意义（P＞0.05），干预15、30 d FBG 水平和FINS 水平均降低（P＜0.05）；铁皮石斛多糖高剂量组干预15、30 d FBG水平和FINS 水平与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。随着干预时间0、15、30 d 增加，模型组FBG 水平持续上升，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组FBG 水平持续下降（P＜0.05）。具体结果见表1。

表1 各组大鼠FBG、FINS水平比较Table 1 Comparison of FBG and FINS levels of rats in various groups（±s）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与二甲双胍组比较；④P ＜0.01，与同组干预0 d比较；⑤P ＜0.05，与同组干预15 d比较

FBG（mmol⋅L-1）FINS（μU·mL-1）5.13±0.73 12.31±1.14①7.26±0.86①②③6.02±0.78①②5.88±0.75①②288.911＜0.001组别正常组模型组铁皮石斛多糖低剂量组铁皮石斛多糖高剂量组二甲双胍组F值P值鼠数（只）15 17 17 17 17干预0 d 5.30±1.67 18.80±1.91①18.90±1.90①18.80±1.89①18.60±1.91①191.394＜0.001干预15 d 5.20±1.60 21.40±2.01①④16.70±1.71①②③④15.50±1.61①②④15.10±1.62①②④275.488＜0.001干预30 d 5.50±1.31 23.50±1.91①④⑤14.30±1.56①②③④⑤12.40±1.41①②④⑤12.10±1.61①②④⑤467.760＜0.001

2. 2 各组大鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C水平比较血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组血清TG、TC、LDL-C 水平升高，HDL-C水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组血清TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高（P＜0.05）；铁皮石斛多糖高剂量组血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。具体结果见表2。

表2 各组大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平比较Table 2 Comparison of serum TG，TC，LDL-C and HDL-C levels of rats in various groups （±s，mmol·L-1）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与二甲双胍组比较

组别正常组模型组铁皮石斛多糖低剂量组铁皮石斛多糖高剂量组二甲双胍组F值P值HDL-C 1.79±0.18 0.72±0.08①0.96±0.10①②③1.29±0.13①②1.31±0.13①②69.419＜0.001鼠数（只）77777 TG 0.67±0.08 1.52±0.16①1.32±0.14①②③1.02±0.11①②0.98±0.10①②50.311＜0.001 TC 2.14±0.31 3.42±0.35①3.13±0.32①②③2.78±0.31①②2.73±0.31①②15.792＜0.001 LDL-C 0.59±0.07 1.35±0.14①1.12±0.15①②③0.83±0.09①②0.84±0.09①②47.754＜0.001

2.3 各组大鼠血清SOD活性、MDA水平比较大鼠血清SOD 活性、MDA 水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组血清SOD活性降低，MDA水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组血清SOD活性升高，MDA水平降低（P＜0.05）；铁皮石斛多糖高剂量组SOD 活性、MDA 水平与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。具体结果见表3。

表3 各组大鼠血清SOD活性、MDA水平比较Table 3 Comparison of serum SOD activity and MDA level of rats in various groups（±s）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与二甲双胍组比较

MDA（nmol·mL-1）1.58±0.23 3.76±0.38①3.22±0.33①②③2.75±0.28①②2.70±0.28①②49.115＜0.001组别正常组模型组铁皮石斛多糖低剂量组铁皮石斛多糖高剂量组二甲双胍组F值P值鼠数（只）77777 SOD（U·mL-1）389.68±40.23 246.51±28.56①287.57±32.36①②③337.64±34.51①②340.42±35.29①②17.796＜0.001

2.4 各组大鼠肝脏组织病理学表现比较正常组肝细胞形态正常清晰，排列规则有序，组织结构完整。模型组出现大量肝细胞水肿坏死现象，组织结构紊乱，排列不均。铁皮石斛多糖低剂量组有少量肝细胞水肿坏死，细胞排列紊乱，病理表现较模型组改善。铁皮石斛多糖高剂量组和二甲双胍组肝细胞形态、排列及组织结构正常，个别肝细胞水肿坏死，病理表现较模型组明显改善。见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织病理表现比较（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of liver histopathologic manifestations of rats in various groups（by HE staining，×100）

2. 5 各组大鼠肝脏组织IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相对表达水平比较 p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR蛋白相对表达水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组肝脏组织p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR 蛋白相对表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，铁皮石斛多糖低、高剂量组和二甲双胍组肝脏组织p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；铁皮石斛多糖高剂量组肝脏组织p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR蛋白相对表达水平与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。而IRS2、PI3K、AKT 蛋白相对表达水平组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。具体结果见表4、图2。

图2 各组大鼠肝脏组织IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相对表达水平比较Figure 2 Comparison of relative protein expression levels of IRS2，p-IRS2，PI3K，p-PI3K，AKT，p-Akt and mTOR in liver tissues of rats in various groups

表4 各组大鼠肝脏组织IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相对表达水平比较Table 4 Comparison of relative protein expression levels of IRS2，p-IRS2，PI3K，p-PI3K，AKT，p-AKT，mTOR in liver tissues of rats in various groups（±s）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与二甲双胍组比较

组别正常组模型组铁皮石斛多糖低剂量组铁皮石斛多糖高剂量组二甲双胍组F值P值mTOR 1.01±0.11 0.38±0.05①0.60±0.06①②③0.84±0.09①②③0.85±0.09①②86.060＜0.001鼠数（只）8 10 10 10 10 IRS2 1.01±0.11 1.01±0.11 1.02±0.12 1.01±0.11 1.02±0.12 0.022 0.999 p-IRS2 0.99±0.11 0.39±0.05①0.61±0.07①②③0.82±0.09①②0.83±0.09①②72.865＜0.001 PI3K 1.22±0.16 1.24±0.15 1.21±0.17 1.22±0.16 1.23±0.17 0.049 0.995 p-PI3K 0.98±0.10 0.38±0.05①0.62±0.07①②③0.83±0.09①②0.84±0.09①②78.485＜0.001 AKT 1.41±0.17 1.42±0.16 1.40±0.17 1.41±0.16 1.42±0.18 0.025 0.999 p-AKT 1.21±0.17 0.61±0.11①0.82±0.12①②③0.99±0.12①②1.01±0.14①②26.819＜0.001

3 讨论

糖尿病发病机制复杂，多数患者伴有血脂代谢异常，胰岛素在调节血糖过程中发挥了重要的作用，可通过调节PI3K/AKT 信号通路，参与葡萄糖转运和脂肪合成过程，调节糖脂代谢[13]。PI3K/AKT 信号通路是胰岛素的下游分子通路，与细胞生长、增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运有关[14]。IRS2 是维持胰岛β 细胞功能的重要信号蛋白，胰岛素与胰岛素受体结合后，使得IRS2 酪氨酸位点磷酸化，磷酸化的IRS2 酪氨酸残基与PI3K的调节亚基p85 结合，进而激活下游的PI3K，活化的PI3K 将磷脂酰肌醇磷酸转化为磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作为其第二信使激活AKT，活化的AKT 激活mTOR 的表达，抑制糖异生限速酶的表达，减少糖异生，降低血糖[15]。蔡羽[16]研究表明，上调PI3K/AKT 信号通路中IRS2、PI3K、AKT、p-AKT 的表达，可有效改善糖脂代谢，减轻肝脏、胰腺和肾脏组织损伤，减少氧化应激。陆梓华等[17]研究表明，上调IRS2、PI3K、AKT2 的表达与调节2 型糖尿病大鼠糖脂代谢异常状态有关。另外，有研究证实，通过激活PI3K/AKT通路，可减少肝脏细胞脂质新生，缓解高脂血症模型大鼠肝脏脂质沉积[18]。

本研究结果显示，经铁皮石斛多糖治疗后的糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、MDA水平降低，HDL-C、SOD 水平升高，肝脏组织病理学变化得到改善，且高剂量铁皮石斛多糖与盐酸二甲双胍疗效无明显差异，提示铁皮石斛多糖可降低血糖，改善脂代谢，促进胰岛素正常分泌，抑制氧化应激反应。另外，本研究结果亦显示，经铁皮石斛多糖治疗后的糖尿病大鼠肝脏组织p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR 蛋白表达上调，表明脂代谢相关指标得到明显改善，提示铁皮石斛多糖可能是通过激活PI3K/AKT 信号通路，改善脂代谢。

综上所述，铁皮石斛多糖可改善糖尿病大鼠脂代谢异常，其可能是通过激活PI3K/AKT 信号通路发挥作用的。