解郁健脾补肾方对大鼠高催乳素血症的干预作用

邓芳， 高修安， 许丽绵

（1.佛山市妇幼保健院，广东佛山 528000；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

高催乳素血症（hyperprolactinemia）是指血清催乳素（prolactin，PRL）＞25 μg/L。女性常常表现为月经过少、闭经，甚至不孕、复发性流产等，严重影响生殖健康[1-2]。目前治疗高催乳素血症，西医首选疗效确切的溴隐亭；因垂体微腺瘤引起的高催乳素血症，常选择手术治疗。但临床上，约12%的患者难于耐受溴隐亭所引起的头晕、幻觉等副作用，且其停药后复发率高[3]，而手术治疗存在垂体功能降低、下丘脑损伤等并发症，治疗费用多难以承受。因此，有必要探寻更经济安全的治疗方法。中医学在治疗高催乳素血症方面积累了丰富的经验。本课题组前期应用疏肝法、温肾法治疗高催乳素血症，取得了一定的疗效[4-5]，为进一步探讨解郁健脾补肾方对高催乳素血症的干预作用，本研究复制了高催乳素血症大鼠模型进行分子水平研究，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 60只SPF级6周龄SD雌性大鼠，体质量（200 ± 10）g，由广东省实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（粤）2018-0002。于广州中医药大学第一附属医院实验中心饲养，室温控制在22～24 ℃，湿度45%～65%，换气次数10～15次/h，每日照射明光12 h、暗光12 h。实验前适应性饲养7 d。

1. 2 药物 解郁健脾补肾方由柴胡15 g、白芍10 g、麦芽10 g、凌霄花10 g、党参15 g、白术15 g、茯苓10 g、桑寄生15 g、杜仲10 g、巴戟天10 g组成。上述中药饮片由佛山市妇幼保健院中药房提供，所有药材均由高修安教授鉴定为正品，符合《中国药典》2015年版[6]规定。由广州中医药大学第一附属医院实验室煎煮并浓缩，保存于2～8 ℃冰箱内备用。

1.3 试剂与仪器 溴隐亭（匈牙利吉瑞药厂，进口药品批号：H20160170）；灭吐灵（甲氧氯普胺）（湖北万得化工有限公司生产，CAS号：4093-35-0）；PRL、雌二醇（E2）、人促卵泡生成素（FSH）放射免疫分析试剂盒（北方生物技术研究所）；转录信号转导子与激活子5（STAT5）抗体（北京百奥莱博公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗体（北京中西华大公司）。SpectraMax i3x多功能酶标仪（美谷分子公司）；TL988-IV实时荧光定量PCR 仪（上海启前电子科技有限公司）；紫外分光光度计（上海菁华科技有限公司）；AlphaImager HP 凝胶成像分析系统（美国AlphaInnotech 公司）；计算机图像分析仪（Image-Pro Plus Analysis Soft ware）。

1.4 动物分组、造模与给药 将60只大鼠随机选10 只作为正常组，其余50 只大鼠构建高催乳素模型。造模方法[7]：皮下注射灭吐灵（多巴胺受体阻断剂）50 mg/kg，每日1 次，连续注射10 日。依据文献[8]，PRL值为正常参考值的3倍以上，即可判定造模成功。造模第11 天取血测量血清PRL 水平，均＞100 μg/L，则提示造模成功。将全部造模成功的50 只大鼠，随机分为模型组，阳性药物组，中药低、中、高剂量组，每组10 只。于实验第12～21 天进行药物干预：按照“人与动物体表面积折算等效剂量比率表”，阳性药物组给予溴隐亭2.0 mg·kg-1·d-1灌胃，中药低、中、高剂量组分别给予解郁健脾补肾方12.6、25.2、50.4 g·kg-1·d-1灌胃，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每日2次（早晚8时），共灌胃10 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 采集标本 行大鼠阴道涂片示排卵后，用100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉采血，离心分离血清，保存于-20 ℃的冰箱中。摘取卵巢组织剥除干净周围的脂肪，存于-80 ℃的冰箱中。

1. 5. 2 检测血清PRL、FSH、E2水平 采用放射免疫法检测血清PRL、E2、FSH水平，具体操作方法按照相关试剂盒说明书进行。

1.5.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测卵巢组织STAT5 的表达 提取卵巢组织蛋白后，制胶、上样、电泳处理，电转移、膜封闭，用TBS-T 洗涤膜10 min×3 次，转移至杂交袋，滴加一抗4 ℃孵育过夜；再用TBS-T洗涤膜10 min×3次，转移至新的杂交袋，滴加二抗37 ℃孵育1 h；TBS-T继续洗涤膜10 min × 3 次，膜表面用电化学发光液（ECL）覆盖，聚偏氟乙烯（PVDF）膜每cm2至少需要0.125 mL ECL 液才能基本被覆盖。包好，蛋白吸附面向上，放入X 光盒中曝光数分钟后，立刻浸入显影液，出现条带显影后清水漂洗，浸入定影液中定影、晾干，扫描分析并保存。

1.5.4 实时定量聚合酶链反应（PCR）法检测催乳素受体（PRLR）mRNA 表达 获取卵巢RNA 提取物，进行体外反转与PCR。离心管内加入以下物质3 μL RNA、1 μL Oligo（dT）引物、9.5 μL ddH2O进行DEPC 定容；70 ℃水浴5 min 后置于冰上，离心后继续加入5 μL 5×Buffer、5 μL dNTP、0.5 μL Ribonuclease Inhibitor、1 μL M-MLV RT；短暂离心后42 ℃水浴60 min 再70 ℃水浴10 min，在离心管内加入1.5 μL cDNA、0.5 μL浓度为10 pmol/μL引物1、0.5 μL 浓度为10 pmol/μL 引物2、10 μL SYBR-Green Mix、ddH2O 补水至20 μL。PCR 程序为94 ℃预变性10 min，再94 ℃15 s、60 ℃1 min、72 ℃10 min共45个循环。采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对定量结果。PCR引物信息见表1。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1. 6 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠血清PRL 水平比较 表2 结果显示：与正常组比较，模型组的血清PRL 值明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性药物组PRL 值明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药各剂量组血清PRL 值与阳性药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清PRL水平比较Table 2 Comparison of serum PRL level of rats in various groups（±s）

表2 各组大鼠血清PRL水平比较Table 2 Comparison of serum PRL level of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组阳性药物组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组PRL（ng·mL-1）20.20±3.01 97.60±2.17①17.10±1.37②18.30±1.06②17.30±1.34②17.50±1.08②鼠数（只）10 10 10 10 10 10

2.2 各组大鼠血清E2、FSH 水平比较 表3 结果显示：与正常组比较，模型组的E2、FSH值显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性药物治疗组E2、FSH 值明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药各剂量组血清E2、FSH 值与阳性药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清E2、FSH比较Table 3 Comparison of serum E2 and FSH levels of rats in various groups（±s）

表3 各组大鼠血清E2、FSH比较Table 3 Comparison of serum E2 and FSH levels of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组阳性药物组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组FSH（mIU·mL-1）7.17±0.18 3.81±0.15①5.12±0.10②5.04±0.13②5.89±0.36②5.20±0.15②鼠数（只）10 10 10 10 10 10 E2（pg·mL-1）72.10±1.79 40.10±2.38①53.50±2.37②55.40±1.71②66.80±2.15②56.80±2.30②

2.3 各组大鼠卵巢组织STAT5蛋白表达比较 表4、图1 结果显示：与正常组比较，模型组卵巢组织STAT5 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性药物组卵巢组织STAT5 蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药中剂量组卵巢组织STAT5 蛋白表达水平明显高于阳性药物组，但仍低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组大鼠卵巢组织STAT5蛋白电泳条带Figure 1 Electrophoresis bands of STAT5 protein in ovarian tissue of rats in various groups

表4 各组大鼠卵巢组织STAT5表达比较Table 4 Comparison of STAT5 protein expression in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

表4 各组大鼠卵巢组织STAT5表达比较Table 4 Comparison of STAT5 protein expression in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与阳性药物组比较

STAT5 1.04±0.27 0.54±0.10①0.69±0.12①②0.78±0.13①②0.97±0.20①②③0.87±0.18①②组别正常组模型组阳性药物组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 10 10

2.4 各组大鼠卵巢组织PRLR mRNA表达比较 表5结果显示：与正常组比较，模型组卵巢组织PRLR mRNA 表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性药物组卵巢组织PRLR mRNA 表达水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药中剂量组PRLR mRNA 表达水平明显高于阳性药物组，但仍低于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表5 各组大鼠卵巢组织PRLR mRNA表达比较Table 5 Comparison of PRLR mRNA expression in ovarian tissue of rats in various groups（±s）

表5 各组大鼠卵巢组织PRLR mRNA表达比较Table 5 Comparison of PRLR mRNA expression in ovarian tissue of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与阳性药物组比较

PRLR mRNA相对表达量1.09±0.20 0.39±0.06①0.50±0.04①②0.45±0.07①②0.67±0.10①②③0.52±0.12①②组别正常组模型组阳性药物组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 10 10

3 讨论

催乳素（PRL）是一种重要的内分泌激素，垂体外合成PRL 的部位主要在子宫内膜，它通过相关信号通路参与子宫内膜的血管生成与分化，支持黄体功能，并与子宫内膜容受性有关[9]。卵泡液中PRL的浓度与雌激素E2浓度相关，PRL基因缺失可使E2水平低下，窦状卵泡个数少，囊胚不易着床[10]。PRL发挥生殖调节功能依赖于PRLR，PRLR表达的部位主要有3 个：非孕期分泌期子宫内膜、蜕膜化子宫内膜基质、卵巢组织[11-12]。适当浓度的PRL与PRLR结合，可调节颗粒细胞FSH受体的表达，促进卵泡发育及孕酮的生成。PRL/PRLR介导蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）、信号转导子与激活子5（STAT5）信号传导途径广泛参与细胞增殖、分化以及免疫调节过程，是多种生长因子和细胞因子传导信号的重要途径[13]，PRL 和PRLR 结合后激活细胞内JAK2，STAT5是JAK2作用的底物，STAT5亦是PRL 生成的重要因子[14]。PRL/PRLR-JAK2/STAT5 传导通路，活化STAT5 反式作用因子，广泛参与子宫内膜血管生成、分化，促进卵泡生长及排出，维持黄体[15-16]，上调子宫内膜α2 巨球蛋白、ERα、ERβ 的表达，参与蜕膜退化与重建[17]。已有研究表明：高催乳素血症可抑制E2的分泌，同时降低E2受体的敏感性，不能形成排卵前的雌激素高峰影响排卵，使子宫内膜容受性降低，黄体功能下降，影响卵泡的发育及排出[18]；高催乳素血症亦可改变PRL/PRLR-JAK2/STAT5 通路效应，降低孕激素酶级联反应，抑制FSH 粒层细胞芳香化酶和雌激素分泌，可导致月经紊乱及卵巢功能降低[7，19]。

高泌乳素血症并无对应的中医学病名，其病因病机及辨证分型认识多有不同。多数医家认为，该病病机主要为肾气不足、肝郁气滞、脾胃运化失常，涉及肾、脾、肝等脏腑，往往与气滞、痰湿、血瘀相关，各因素互根互用[5]。本课题组综合文献研究与临床经验，拟制解郁健脾补肾方，方中柴胡入肝胆经，疏肝解郁、升举阳气，白芍疏肝理气、柔肝养血，二者配伍可加强疏肝解郁之效；麦芽健脾消食，凌霄花散结、活血化瘀；党参入脾经，健脾益肺，益气生津，白术健脾燥湿化痰，固表止汗，茯苓健脾和胃，利水渗湿，党参、白术、茯苓合用健脾和胃，增强体质；桑寄生入肝肾经，补肝肾，通经络，杜仲常配巴戟天以补肾、壮筋骨、祛风湿。诸药合用，共奏解郁健脾补肾之功，同时有行气、化痰、祛瘀之效。现代药理研究发现：柴胡含有的柴胡皂苷、柴胡醇、α-菠菜甾醇，均有护肝、保肝之效，对动物实验性肝损伤亦有防治作用[20]；白芍中的白芍苷可以刺激卵巢颗粒细胞生成甾体类激素，亦有保肝、护肝的作用[21]；麦芽含有的麦角类化合物可结合下丘脑及其受体，类似多巴胺激动剂样作用，使泌乳素释放因子增强，抑制PRL 分泌[22]；党参、茯苓、白术有调节机体免疫的功能[23]；桑寄生、巴戟天可促进下丘脑产生GnRH，增加垂体对GnRH 及LH-RH 的敏感性，进而刺激FSH、LH 抑制PRL 的产生，促进卵泡发育，提高血中E2的水平，从而调节机体内分泌平衡[24-25]。

本研究结果显示：与正常组比较，模型组PRL值明显升高，E2、FSH 水平，STAT5 蛋白、PRLR mRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，中药各剂量组PRL值均明显降低，E2、FSH水平，STAT5 蛋白、PRLR mRNA 表达水平显著增高（P＜0.05）。表明高催乳素血症大鼠卵巢组织PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信号传导通路相关因子表达下降，可引起下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱，抑制性激素的分泌；经解郁健脾补肾方治疗，PRL 水平降低，PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信号通路相关蛋白PRLR、STAT5 的表达增强，且与PRL 浓度有关。

综上所述，解郁健脾补肾方可以有效改善高催乳素血病，提高PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信号传导通路相关因子PRLR、STAT5 的表达，进而促进卵泡发育，诱导排卵，从根本上调整性腺轴的功能，增强卵巢的内分泌调节，体现出中医药治疗该病的优势和前景。