滋癸益经汤治疗卵巢早衰作用机制的网络药理学研究

杨益雯， 田海艳， 罗颂平， 赵颖

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院妇科，广东广州 510405）

卵巢早衰（premature ovarian failure）是指女性40 岁以前出现闭经、促性腺激素水平升高（FSH＞40 U/L）和雌激素水平降低，并伴有潮热、盗汗、阴道干涩等围绝经期症状，是早发性卵巢功能不全（POI）的终末阶段[1]。据统计，卵巢早衰的发病率约为1%，并呈逐年上升的趋势[2]。目前，POI诊疗指南推荐的治疗方法主要为激素补充治疗（HRT）[3]，该法可改善患者的临床表现，但在帮助卵巢早衰患者生育方面暂无有效方法，且即使使用最接近天然的激素，也可能提高乳腺癌的发生率[4]。卵泡体外激活虽有妊娠的案例但成功率低[5]。其他治疗方法如免疫、干细胞、基因编辑等尚在研究阶段[3]。相比之下，中医药治疗卵巢早衰取得了不错的疗效，且副作用小，具有一定优势。

张玉珍教授为妇科名家，是岭南罗氏妇科代表性传承人，其团队在国内以中医药防治卵巢早衰处于领先地位。她认为，卵巢早衰病机以肾虚为主，累及心、肝、脾多脏，拟定专病专方滋癸益经汤[6]。该方由菟丝子、枸杞子、人参、淫羊藿、熟地黄、丹参、柴胡、炙甘草8 味中药组成，临床与实验研究证明，该方可降低患者的促性腺激素（FSH）和促卵泡生成素（LH）的水平，提高雌二醇（E2）和抗苗勒氏管激素（AMH）的水平，改善卵巢血供，增加子宫内膜厚度[7-8]，还可改善卵巢储备功能，可通过增强自身免疫性POI小鼠卵巢抑制素B 的信使RNA 表达来提高抑制素B 的浓度[7]；但其主要活性成分及作用机制尚不完全明确。本研究采用中药网络药理学方法，以“网络靶向多组分”为主要研究模式，通过检索在线数据库构建“疾病-基因-靶点-药物”网络，通过数据挖掘药物对多种信号通路的调节作用预测药物活性成分、体内作用靶点、作用机制等[9]，探讨该方治疗卵巢早衰的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 获取滋癸益经汤活性成分及靶标 以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选标准，在中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库中对方中组成中药菟丝子、枸杞子、人参、淫羊藿、熟地黄、丹参、柴胡（TCMSP数据库中未收录炙甘草，故本研究未纳入）进行检索，获得该方活性成分，并根据活性成分查找得到对应的靶标蛋白。

1.2 搜集卵巢早衰靶标 分别通过在线文本挖掘服务器GeneCards（https://www.genecards.org/）和在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（https://omim.org/），以“premature ovarian failure”和“POF”为关键词检索卵巢早衰的相关靶点，建立卵巢早衰疾病靶点数据集。

1.3 搜集滋癸益经汤作用于卵巢早衰的靶点 查询UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/），为该方活性成分对应靶标添加简称。利用R 4.0.2 软件对该方活性成分作用的靶标和卵巢早衰相关的靶标取交集，获得潜在作用靶点，并绘制交集图。

1.4 构建“活性成分-作用靶点”关系网络 将滋癸益经汤的活性成分、潜在作用靶点作用关系导入Cytoscape 3.7.2 软件，得到“活性成分-作用靶点”网络。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络 将潜在作用靶点导入STRING（https://string-db.org/）数据库中，以置信度分数（Score）≥0.900（高置信度）为条件进行筛选，去除没有联系的节点，得到作用靶点蛋白之间相互作用网络，获得PPI 网络关系图和文件。利用R 4.0.2 软件筛选出连线最多的前20 位的靶点，绘制柱状图。将前10 位靶点相互作用关系导入Cytoscape 3.7.2 软件，得到它们之间的相互作用网络。

1.6 基因富集分析 利用David 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov）对潜在作用靶点进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，探讨滋癸益经汤治疗卵巢早衰可能的生物学功能和主要的信号通路。本研究以P＜0.05为筛选条件，分别选取富集结果的前20 条GO 生物功能和KEGG 信号通路，利用R 4.0.2软件进行可视化。

1.7 构建“潜在靶标-KEGG 通路”关系网络 查阅相关文献，从KEGG 富集的前20 条通路中筛选可能与卵巢早衰有关的通路，将其与靶标关系文件导入Cytoscape 3.7.2 软件，进一步得到“潜在靶点-KEGG 通路”关系网络图。

2 结果

2.1 滋癸益经汤的活性成分及其靶标 通过TCMSP平台，筛选得到菟丝子的活性成分有11 种、人参22 种、枸杞子45 种、熟地黄2 种、淫羊藿23 种、柴胡17种、丹参65种。剔除重复部分后，该方得到167 种活性成分，将其活性成分输入TCMSP 平台检索并删除重复靶标后，得到278个靶标。检索UniProt数据库，为靶标添加简称。

2.2 卵巢早衰的靶标 按“1.2”项方法检索并删除重复靶标后，获得卵巢早衰相关的靶标997个。

2. 3 滋癸益经汤治疗卵巢早衰的潜在靶点 按“1.3”项的方法对“2.1”项和“2.2”项的靶标取交集，得到69 个滋癸益经汤治疗卵巢早衰的潜在作用靶点，见图1。

图1 滋癸益经汤治疗卵巢早衰潜在靶点的韦恩图Figure 1 Venn diagram of potential targets of Zigui Yijing Decoction for treatment of POF

2.4 “成分-靶标”网络的构建 将编排后的滋癸益经汤的278 个活性成分、治疗卵巢早衰的69 个潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件可视化，获得“滋癸益经汤活性成分-卵巢早衰潜在靶点”关系网络，见图2。其中，黄色部分代表滋癸益经汤组成中药，蓝色代表中药的活性成分，绿色部分代表卵巢早衰潜在靶点。网络中活性成分与潜在靶点连线越多，即度（Degree）值越高，与卵巢早衰治疗的相关性越大，Degree 值前10 位的活性成分如表1所示。

表1 滋癸益经汤活性成分[度（Degree）值前10 位]Table 1 Active ingredients of Zigui Yijing Decoction（top 10 in Degree value）

图2 “滋癸益经汤活性成分-卵巢早衰潜在靶点”关系网络Figure 2 Relationship network of“active ingredients of Zigui Yijing Decoction-potential targets of POF”

2.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建及拓扑结构的分析 将滋癸益经汤治疗卵巢早衰的69 个潜在靶点录入STRING 数据库，获得蛋白质-蛋白质相互作用的关系网络图，结果如图3。其中，AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF 位于核心基因位置。结果如图3～5。

图3 滋癸益经汤治疗卵巢早衰的蛋白质-蛋白质相互作用网络Figure 3 Protein-protein interaction network of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF

图4 度（Degree）值排名前20位的滋癸益经汤治疗卵巢早衰靶点Figure 4 The top 20 targets of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF in Degree value

图5 滋癸益经汤治疗卵巢早衰前10 位潜在靶标的互作网络图Figure 5 Interaction network of the top 10 potential targets of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF

2.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用David在线数据库，将69个潜在靶点进行GO和KEGG分析。得到GO分子功能富集条目74个。根据P值从小到大的顺序，选取前20 个分析条目进行可视化，以条形的长度代表相应条目所富集基因数。结果显示，这69 个潜在靶点的分子功能主要富集在类固醇结合、氧化还原酶活性、细胞因子活性等方面。结果如图6所示。

图6 GO分子功能富集分析结果Figure 6 Analysis results of GO molecular function enrichment

共富集127条KEGG信号通路，去除与其他器官癌症相关的通路，按照P值从小到大的顺序筛选前20条，主要包括：缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、叉头盒O（FoxO）信号通路、p53 信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路等。结果如图7所示。

图7 KEGG 通路富集分析结果Figure 7 Enrichment analysis results of KEGG pathways

2.7 构建KEGG通路关系网络 将富集的前20条KEGG 通路关系文件导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建“潜在靶点-KEGG 通路”关系网络图，并计算KEGG 通路和潜在靶点的Degree值。其中，橙色部分代表KEGG通路，橙色节点为通路上富集的潜在靶点，蓝色节点代表靶标参与的通路。根据KEGG关系网络，筛选出节点连接Degree 值排名前20 位的靶标。这些靶标是网络中连接度最大、最重要的靶标。其中，IL6、AKT1、TGFB1、TNF等13个靶标也是蛋白质-蛋白质相互作用网络关系网络中的核心基因。查阅相关文献，得出槲皮素、木犀草素、山柰酚是治疗卵巢早衰的主要潜在活性成分。这些活性成分的核心作用靶标中，IL6、AKT、IL10、IL2、TP53、MYC、第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）这7 个靶标同时也是PI3K/Akt、HIF-1、p53、FoxO 这几个与卵巢早衰密切相关的信号通路中的靶点蛋白，以此构建“药物-活性成分-潜在靶点-KEGG 通路”关系网络图。结果见图8～9、表2。

图8 “潜在靶点-KEGG 通路”关系网络图Figure 8 Network diagram of“potential targets-KEGG pathways”

图9 “药物-活性成分-潜在靶点-KEGG 通路”关系网络图Figure 9 Network diagram of“drugs-active ingredients-potential targets-KEGG pathways”

表2 KEGG关系网络连接度（Degree）值前20位的靶标Table 2 The targets in the top 20 Degree values in KEGG relational network

3 讨论

张玉珍教授认为，卵巢早衰是因脏腑、气血、天癸、冲任、胞宫先后受病，导致脾肾两虚、肝气郁滞、血枯瘀阻，逐渐致天癸、冲任衰少，血海空虚，胞宫失于濡养而发病[10]，治疗需补肾健脾、调肝活血，以此创立治疗卵巢早衰的专方滋癸益经汤。方中菟丝子和人参同为君药，养肝血填肾精，大补脾肺之气；枸杞子滋肝补肾，熟地黄补血养阴，淫羊藿温肾壮阳，三者共为臣药；柴胡、丹参疏肝活血为佐；炙甘草调和诸药为使。该方效果良好，但是其疗效机制尚不明确。本研究借助在线数据库共筛选得到滋癸益经汤活性成分167种，药物靶点基因278个，与疾病的交集基因69 个，筛选得到与治疗卵巢早衰有关的潜在活性成分130种，其中，部分化合物的有效性及作用机制已被证实。

从“药物-活性成分-潜在靶点-KEGG 通路”关系网络图中分析，该方中菟丝子等7味中药富含的槲皮素、木犀草素、山柰酚3种生物类黄酮，可能是该方的主要有效成分。这些生物类黄酮可直接作用于Akt。槲皮素和木犀草素还可以通过作用于白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素2（IL-2）2 种细胞因子及第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）间接作用于Akt。结合信号通路图和相关文献研究发现，Akt 可以通过PI3K/Akt信号通路磷酸化下游靶点因子诱导血管生成来增加卵巢内血供，从而恢复卵巢功能[11]，故推测这可能是滋癸益经汤改善卵巢血供的作用机制。

滋癸益经汤改善卵巢早衰患者激素水平的机制较为复杂，涉及多个有效成分和信号通路。已知HIF-1、p53、FoxO 信号通路是PI3K/Akt 信号通路的下游信号通路，均由靶激酶Akt磷酸化下游靶点因子发挥作用[12]。HIF-1信号通路负责调节氧稳态，当HIF-1 信号通路被激活时，氧气输送增加，消耗减少，可在缺氧和常氧条件下不同程度地调节包括卵泡细胞在内的各种组织细胞增殖[13]。p53信号通路是细胞衰老和凋亡中的一环，当通路中的肿瘤抑制因子p53 蛋白（TP53）因DNA 损伤、低氧和癌基因激活等应激信号激活时，细胞周期停滞，细胞走向凋亡[14]，Akt可以通过磷酸化TP53的上游靶点抑制TP53 的功能。但也有研究提出相反结论[15]。FoxO 信号通路中FoxO3a 是卵泡激活的关键调节因子，由Akt磷酸化激活，可抑制原始卵泡的过早及过度激活，保持卵巢中的卵泡储备，FoxO3a 功能异常的小鼠的原始卵泡在性成熟前整体激活，从而使卵巢过早衰竭[16]。PI3K/Akt信号通路中的PTEN也有抑制原始卵泡激活的作用，维持卵巢中的卵泡储备[17]。滋癸益经汤可能通过以上通路和靶点调节卵巢组织细胞增殖、抑制凋亡、抑制原始卵泡过早激活来改善卵巢早衰患者体内性激素和AMH 的水平。动物实验也印证了槲皮素、木犀草素、山柰酚对FSH、LH、E2、AMH水平的正面影响以及对卵巢细胞增殖和原始卵泡情况的改善[18-21]。

另外，槲皮素的作用靶点MYC 亦是PI3K/Akt信号通路中的下游靶点，与细胞周期相关，值得进一步探讨。

GO 富集分析结果表明，滋癸益经汤治疗卵巢早衰的生物学过程主要体现在氧化还原酶活性、类固醇结合、细胞因子活性上。氧化应激会使卵巢颗粒细胞的蛋白质、DNA 等氧化损伤，最终导致细胞凋亡，故抑制氧化应激过程可以保护卵巢细胞[22]。类固醇结合蛋白（SHBG）可以与性激素特异性结合并转运，当其编码基因出现问题导致SHBG功能减弱时，雄激素活性降低，卵泡生长失调，引起卵巢早衰[23]。以此推断，提高类固醇结合性或许可以改善卵巢早衰。参与卵巢早衰的细胞因子主要包括TNF-α 和INF-γ 等，降低这些细胞因子的表达水平，可有效抑制卵巢颗粒细胞凋亡，从而使卵巢功能得到恢复[24-26]。本研究GO 富集分析的结果与文献报道基本一致，据此推断，滋癸益经汤治疗卵巢早衰涉及氧化还原酶活性、类固醇结合、细胞因子活性等多种复杂的生物过程。

综上所述，滋癸益经汤治疗卵巢早衰的作用机制涉及多个活性成分、作用靶点及生物通路。槲皮素、木犀草素、山柰酚等是滋癸益经汤中治疗卵巢早衰的主要活性成分，它们通过作用于IL6、AKT1、PTEN 等靶标蛋白，影响PI3K/Akt、HIF-1、FoxO、p53 信号通路，从而治疗卵巢早衰。滋癸益经汤治疗卵巢早衰的作用机制可能还与抗氧化应激、原始卵泡激活、细胞增殖和凋亡等途径相关，需进一步通过实验验证。