基于游离氨基酸、挥发性组分和感官评价的2 种酸化技术加工乳饼的滋味特征差异分析

魏光强，李子怡，黄艾祥,*，万长江

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003）

乳饼是滇中彝族、路南撒尼族地区的一种传统酸凝新鲜干酪，其历史悠久，风味独特，传统的直接酸化乳饼是通过向原料乳中添加自然发酵的酸乳清或酸醋，以及酸木瓜、奶浆藤的浸提液，在高温条件下（85～90 ℃）酸促凝乳，排乳清，然后在模具里压制成型制得[1]。乳酸菌在酸乳制品中起着主要作用，乳酸菌发酵可产生有机酸、呈味氨基酸、呈味肽等滋味物质，以及脂肪酸类、醇、醛、酯、酮等挥发性风味物质，从而改善发酵乳制品风味。前期研究通过添加乳酸菌发酵酸化，再辅助加热凝乳，研发了一种发酵型乳饼的加工工艺。

干酪的滋味主要源于蛋白质和脂肪的降解[2-3]，其中提供基本滋味的物质主要有氯化钠（提供咸味）、乳酸（提供酸味）、游离氨基酸和游离脂肪酸（提供甜、鲜、苦等多种滋味）等[4]，滋味物质也是风味物质的前体物，可进一步分解为挥发性风味物质，对干酪的风味具有重要作用[5]。Toelstede等[6]分别对成熟4 周和44 周的Gouda奶酪中的49 种滋味活性物质和矿物质盐进行全面定量测定，丛艳君等[7]运用电子舌技术对不同时间超声处理的奶酪滋味进行区分，马杨等[8]研究了新疆特色酸凝奶酪成熟过程中非挥发性风味物质（有机酸、游离氨基酸、游离脂肪酸）的变化；马艳丽等[9]利用固相微萃取-气相色谱-质谱检测了乳饼中的挥发性风味物质。部分学者将组学技术应用于奶酪制品[10-11]和发酵乳制品[12-13]的风味特征分析中，该技术将感官与风味成分结合分析相应风味物质贡献的特征感官风味，并分析二者的相关性。目前，对乳饼的研究主要集中在加工工艺[14]、成分分析[15]以及乳酸菌的分离鉴定[16]等，对乳饼中的非挥发性风味物质研究较少，乳饼的特征滋味物质尚不明确。

本研究采用氨基酸分析仪和气相色谱仪对传统酸水直接酸化乳饼和发酵型酸化乳饼的主要特征呈味物质（游离氨基酸、游离脂肪酸）进行定量测定，采用滋味活度值（taste activity value，TAV）判定特征呈味物质；采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法和偏最小二乘（partial least squares，PLS）法分析乳饼中的特征呈味物质与感官属性之间的相关性，确定对每个感官属性有显著性贡献的呈味物质，旨在揭示不同加工工艺对乳饼中主要特征呈味物质的影响，为乳饼工艺的改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荷斯坦牛奶：由云南德摩菲尔生物科技有限公司提供，其主要成分含量为蛋白质3.1%、脂肪3.4%、总固体含量11.84%、乳糖4.88%，酸度13.38 °T。

自然发酵酸乳清：加工乳扇、乳饼剩余的乳清装于密闭的玻璃罐中，在自然条件下发酵15～20 d而成，pH值在3.0～3.2之间。

实验菌株：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）为CICC菌株；罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）由用于生产乳扇、乳饼的酸乳清中分离鉴定，4 株菌活化至活菌数大于108CFU/mL时按体积比1∶1∶2∶2复配，菌液经离心后除去上清液，并用磷酸盐缓冲液冲洗，加入冻干保护剂后进行冷冻干燥制得直投式发酵剂（活力为2.6×107CFU/g）。

三氯乙酸（分析纯） 天津市风船化学试剂有限公司；正己烷、甲醇（均为色谱纯） 德国默克股份有限公司；柠檬酸、葡萄糖、咖啡碱、氯化钠、谷氨酸钠、丁酸、乙醇（均为食品级） 河南万邦化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SVJ-358智能商用型酸奶机 北京世纪阳光公司；SW-CJ-IF单人双面超净无菌操作台 苏州江东精密仪器有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；30氨基酸自动分析仪 英国Biochrom公司；7890A气相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 乳饼样品的制备

传统酸水乳饼（直接酸化技术）加工工艺：新鲜牛奶→杀菌（85 ℃、15 min）→添加自然发酵酸乳清（按牛奶∶酸乳清=6∶1（V/V）比例添加酸乳清）→调整pH值至4.8→凝乳（85～90 ℃，5 min）→形成凝乳颗粒→过滤→压制成型→传统酸水乳饼。

发酵型乳饼（发酵酸化技术）加工工艺：新鲜牛奶→杀菌（85 ℃、15 min）→冷却（38～42 ℃）→接种发酵剂（质量分数0.2%～0.3%）→发酵（42 ℃，发酵至终点pH值为4.9）→升温凝乳（65 ℃、30 min）→形成凝乳块→过滤→压制成型→发酵型乳饼。

按照上述工艺分别制得传统酸水乳饼样品3 份（记为SS1、SS2、SS3）和发酵型乳饼样品3 份（记为FJ1、FJ2、FJ3），置于4 ℃冰箱保藏7 d，备用。

1.3.2 感官评价

釆用定量描述性感官评价方法[17-18]，选取10 点制，0～3 分（弱）；4～7 分（中等）；8～10 分（强）。评定小组由10 人组成，6 男4 女，年龄在21～30 岁之间，酸、甜、苦、咸、鲜和异味6 种基本味道分别选取柠檬酸、葡萄糖、咖啡因、氯化钠、谷氨酸钠、10%丁酸+8%乙醇作参照物，参照物质量浓度如表1所示[19-22]。在室温环境下称取20 g乳饼置于洁净的培养皿中，切成2 cm×1 cm×1 cm的小块，采用3 位数字随机编码的方式呈递样品进行滋味感官评价。

表1 感官评价Table 1 Criteria for sensory evaluation of milk cakes

1.3.3 游离氨基酸含量测定

根据GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》采用氨基酸自动分析仪检测。准确称取粉碎的乳饼1.00 g，用5 g/100 mL的三氯乙酸溶液定容至25.0 mL，摇匀，静置1 h后，采用双层滤纸过滤，所得滤液于10 000 r/min离心10 min，取上清液至进样瓶中，用全自动氨基酸分析仪上样分析。

1.3.4 游离脂肪酸含量测定

根据GB 5413.27—2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》的乙酰氯-甲醇甲酯化法经气相色谱仪分离检测游离脂肪酸。采用罗兹-哥特里法提取样品的粗脂肪，准确称取粗脂肪0.05～0.10 g于螺帽小玻璃瓶中，加入0.5 mL正己烷和1 mL 10%的HCl-甲醇溶液，振荡混匀后进行甲酯化，60 ℃水浴3 h并每隔30 min振荡一次。甲酯化结束后，再加入1 mL饱和NaCl、1 mL正己烷，3 000 r/min离心3 min，将上清液转移至小管中。向原体系中再加入1 mL饱和NaCl、1 mL正己烷，3 000 r/min离心3 min再次提取。将2 次提取得到的溶液混合，用氮气吹干，加入1 mL正己烷溶解，取0.5～1 mL样液于进样小瓶中，气相色谱检测。

气相色谱条件：DB-WAX色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；氢火焰离子检测器。进样口温度240 ℃，采用分流进样，分流比为15∶1，载气流量2 mL/min。程序升温：120 ℃维持3 min，按5 ℃/min升至190 ℃，按1 ℃/min升温至210 ℃，并保持3 min。

脂肪酸甲酯混合标准液用正己烷稀释成不同浓度梯度，峰面积采用外标法进行定量分析。

1.3.5 特征呈味物质的筛选

参考Warmke等[23]的方法，利用TAV评价各呈味物质对乳饼滋味的影响。TAV按下式计算：

1.4 数据处理与分析

采SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差异显著；P＜0.001，差异极显著；采用Origin 2019b软件进行图表绘制以及对感官数据的PCA；使用SIMCA软件（V15.0.2）进行PLS相关性分析。

2 结果与分析

2.1 感官分析

2.1.1 感官评价结果

如图1所示，单因素方差分析结果显示，2 种工艺加工乳饼的酸味、甜味、苦味、鲜味和异味存在极显著差异（P＜0.001），总体滋味强度差异显著（P＜0.05），而咸味差异不显著，咸味主要由氯化钠、磷酸钠和精氨酸引起[4]，乳饼作为国内的传统酸凝奶酪，加工过程无需添加氯化钠，故咸味较弱[14]。传统酸水乳饼的异味较重，原因是加工过程通过添加自然发酵的酸乳清直接酸化制作乳饼，从而把酸乳清中的霉味、腐败味和乙醇味带到了乳饼中，导致乳饼中存在不洁气味，此研究与马艳丽等[9]的研究结果一致。发酵型乳饼的甜味、苦味、鲜味以及酸味较高，原因是发酵型乳饼加工过程中乳酸菌发酵，分解蛋白和脂肪产生更多的游离氨基酸和游离脂肪酸等呈味物质。综上，乳饼的滋味特征以鲜味为主[7]，传统工艺加工的乳饼甜、鲜和苦味较为融洽，但存在腐败味等不良气味，而发酵型乳饼的甜味、鲜味、苦味及酸味强度得以提升，不愉悦的滋味有所降低。

图1 乳饼的感官评分雷达图Fig.1 Radar chart of sensory scores of milk cakes

2.1.2 乳饼样品与感官属性的PCA

采用Origin 2019b软件对传统酸水乳饼和发酵型乳饼的滋味感官评分进行PCA，如表2及图2所示。前3 个因子的特征值之和占总特征值的98.70%，能够解释原变量的大部分信息。PC1重点反映了酸味、甜味、苦味、鲜味4 个指标的变异信息，且都处于PC1轴的正方向，特征向量值均大于0.37，这表明总体滋味强度与酸味、甜味、苦味、鲜味呈主要正相关，与咸味和异味呈负相关；PC2重点反映了咸味、异味等不良滋味的变异信息；PC3与酸味指标呈正相关，与苦味指标呈负相关。由图2可知，传统酸水乳饼和发酵型乳饼在距离上有明显区分；发酵型乳饼的滋味特征比较丰富，包括了酸味、甜味、苦味、鲜味等滋味特征，与总体滋味强度呈正相关；而传统酸水乳饼总体滋味特征较弱，且伴有不愉悦的异味和淡淡的咸味。

图2 乳饼样品与感官属性的PCAFig.2 PCA plot of sensory attributes of milk cake samples

表2 PC载荷矩阵Table 2 Principal component loading matrix

2.2 2 种酸化技术加工乳饼的呈味物质比较分析

2.2.1 游离氨基酸含量及TAV分析

乳饼中的游离氨基酸由加工和成熟期间蛋白质和多肽降解产生[24]，游离氨基酸种类和含量的增加有助于提高乳饼的营养价值，丰富乳饼的滋味[25]。由表3可知，发酵型乳饼的游离氨基酸总量（186.68～205.43 mg/kg）显著高于传统酸水乳饼（103.34～113.53 mg/kg），对增强乳饼的感官风味具有积极作用，田帅等[26]测定了酸水乳饼中的游离氨基酸含量，为85.93 mg/kg，与本研究略有差异，可能与乳源和加工用酸水有关。传统酸水乳饼中谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸含量较高；发酵型乳饼中谷氨酸含量最高，其次是组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。在4 类呈味氨基酸中，鲜味氨基酸和甜味氨基酸是构成乳饼特殊滋味的最主要成分，虽苦味氨基酸含量较高，但呈苦味的氨基酸不具有味觉活性，被甜味和鲜味物质所掩盖，最终使乳饼呈现独特的鲜甜滋味[27]。TAV是滋味物质对于整体滋味的贡献程度的表征指标，当TAV大于1时该物质被认为具有强烈的滋味活性，对整体滋味具有较大的贡献[28]。在所有的游离氨基酸中，只有谷氨酸（SS：0.61～0.75；FJ：1.09～1.26）、缬氨酸（SS：0.15～0.18；FJ：0.27～0.30）、蛋氨酸（SS：0.22～0.27；FJ：0.32～0.34）、组氨酸（SS：0.92～1.04；FJ：1.35～1.51）和精氨酸（SS：0.13～0.19；FJ：0.11～0.14）5 种游离氨基酸的TAV大于0.1，但除组氨酸均小于1，表明以上5 种氨基酸对于乳饼滋味的贡献最大，但仍未达到显著影响的水平（除组氨酸外）。研究表明，谷氨酸可以提供强烈的鲜味，是重要的鲜味氨基酸[29-30]，此外，精氨酸可以与谷氨酸协同作用以提供令人愉快的整体味道。发酵型乳饼的鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸的含量显著高于传统酸水乳饼（P＜0.05），赋予发酵型乳饼浓郁的滋味，与感官评价结果一致。

表3 乳饼中的游离氨基酸含量、阈值、呈味特性及TAVTable 3 Contents, thresholds in water, taste attributes and TVAs of free amino acids in milk cakes

2.2.2 游离脂肪酸含量及TAV分析

由表4可知，从传统酸水乳饼和发酵型乳饼中共检测到了10 种游离脂肪酸，其中油酸、棕榈酸和硬脂酸含量较高。发酵型乳饼中的游离脂肪酸总量在1 0343～1 0580 μg/g之间，显著高于（P＜0.05）传统酸水乳饼（9 335～10 000 μg/g），原因是乳酸菌发酵过程的脂肪分解，增加了乳饼中的游离脂肪酸含量，检测到的游离脂肪酸以中链脂肪酸和长链脂肪酸为主，其中油酸（SS：3 564～3 651 μg/g；FJ：3 428～3 703 μg/g）和棕榈酸（SS：2 382～2 803 μg/g；FJ：2 677～2 807 μg/g）是主要游离脂肪酸。癸酸（SS：0.73～1.36；FJ：0.8～1.13）、月桂酸（SS：206～362；FJ：332～406）、肉豆蔻酸（SS：1.49～1.95；FJ：1.84～2.05）、油酸（SS：1.78～1.85；FJ：1.71～1.79）和亚油酸（SS＜1；FJ：1.26～1.35）的TAV大于1，这5 种呈味脂肪酸对乳饼的滋味有着重要贡献，其中月桂酸由于其阈值较低所以TAV最大。中长链游离脂肪酸中月桂酸、肉豆蔻酸、油酸和亚油酸与乳饼的酸味和苦味高度相关，它们主要赋予奶酪酸味和苦味[31]；癸酸具有不适的酸败味[32]，可能与乳饼成熟过程的微生物作用有关。发酵型乳饼中肉豆蔻酸、亚油酸含量高于传统酸水乳饼，所以酸味和苦味较强，和感官评分结果一致。综上，不同中长链游离脂肪酸之间的协同作用共同构成发酵型乳饼和传统酸水乳饼的特有酸香味和醇香味[33]。

表4 乳饼中的游离脂肪酸含量、阈值、呈味特性及TAVTable 4 Contents, taste thresholds, taste attributes and TAVs of free fatty acids in milk cakes

将游离氨基酸和脂肪酸含量进行归一化处理后绘制聚类热图。从图3A可直观看出，谷氨酸、组氨酸，棕榈酸和油酸在传统酸水乳饼和发酵型乳饼的相对丰度较高，发酵型乳饼中大多数游离氨基酸丰度高于传统酸水乳饼，而游离脂肪酸含量差异不明显。Pearson相关分析用于确定关键滋味物质含量之间的相关性，如图3B所示，月桂酸、癸酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸之间呈正相关，油酸与月桂酸、癸酸以及缬氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸呈正相关。

图3 传统酸水乳饼和发酵型乳饼的呈味物质热图（A）和关键呈味物质相关性热图（B）Fig.3 Heat map of flavor substances (A) and correlation heat map of key flavor substances (B) of traditional and fermented sour milk cakes

2.3 感官特性与风味物质的相关性分析

为了探究检测得到的滋味物质对乳饼风味的贡献程度，以检测得到滋味物质作为X变量，感官属性作为Y变量建立PLS感官评定与滋味物质的关系，从而推断游离脂肪酸、游离氨基酸与感官属性的相关性，2 个变量之间的距离说明两者之间的相关性，位置越接近，正相关性越强，解释性越强；两者在距离圆心相反的位置，负相关性越强；两者越垂直，越不相关。从图4可知，咸味和异味与精氨酸、半胱氨酸、癸酸、油酸和棕榈烯酸密切相关，酸味、甜味、鲜味和苦味与大多数氨基酸以及硬脂酸和亚油酸和十五烷酸密切相关。

图4 感官属性与游离脂肪酸（A）和感官属性与游离氨基酸（B）PLS分析Fig.4 PLS analysis of correlation between sensory attributes and free fatty acids (A) and free amino acids (B)

为进一步研究感官属性与特征呈味物质的相关性，Pearson相关系数关联性分析用于确定每个感官属性显著相关的特征呈味物质。从图5可以明显看出，酸味、甜味、鲜味以及总体滋味强度和呈味物质基本呈正相关，特别和游离氨基酸相关性系数较高，而咸味、异味和呈味物质基本呈负相关。酸味与硬脂酸和亚油酸，甜味与天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸以及亚油酸，苦味与缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸等苦味氨基酸以及肉豆蔻酸均呈正相关；鲜味与天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸呈正相关，和甘氨酸和棕榈烯酸呈负相关；总体滋味强度与大多数的呈味氨基酸呈正相关，与棕榈烯酸呈负相关；咸味与精氨酸呈正相关；异味和甘氨酸、癸酸和棕榈烯酸呈正相关，相关性均显著（P＜0.05）。

图5 感官属性和呈味物质的相关性图谱Fig.5 Correlation map between sensory attributes and taste compounds

3 结 论

研究测定了传统酸水乳饼和发酵型乳饼的27 种呈味物质，采用TAV判定法确定7 种主要的特征呈味物质。在感官和呈味物质组成方面，2 种酸化技术加工的乳饼明显区分开来，发酵型乳饼的呈味物质含量显著高于传统酸水乳饼（P＜0.05），感官属性以酸味、甜味、苦味和鲜味为主，而传统酸水乳饼伴有不愉悦的异味，说明乳酸菌发酵能提升乳饼的呈味物质含量，进而改善乳饼的风味。乳饼感官属性与游离氨基酸相关性高，传统酸水乳饼的咸味与精氨酸，异味与甘氨酸、癸酸与棕榈烯酸呈显著正相关（P＜0.05）；发酵型乳饼的酸味、甜味、鲜味和苦味与大多数特征呈味物质均有显著相关性。综上，发酵酸化技术能促进乳蛋白和脂肪的分解，改善乳饼的滋味，研究可为乳饼生产工艺的改善提供一定的科学依据。