超声波辅助铃兰总强心苷提取工艺的优化*

黄泰奇，李成成，朱 锐，黄启东，金卫华

（武汉东湖学院 生命科学与化学学院，湖北 武汉430212）

强心苷是由强心苷配基与糖类缩合成的苷类，常见于夹竹桃科、百合科的植物中。自上世纪30年代地高辛被成功分离起，已经有多种强心苷用于治疗心力衰竭及某些心律失常，但由于强心苷有效剂量与中毒剂量接近，故其应用受到限制[1]。但近些年来发现强心苷具有抗肿瘤、镇痛等作用[2，3]，强心苷类化合物的应用再次受到关注。

铃兰（Convallaria keiskei Miq.）为百合科铃兰属植物,别名山谷百合。具有药用、观赏价值[4]。铃兰花含挥发油等芳香物质，可制作香料并应用于食品及日化工业。铃兰含有强心苷、皂苷等活性成分，其中，铃兰毒苷曾用于急性及慢性心力衰竭，近些年来还发现其有抗衰老的功能[5]。陈玉昆等人以铃兰毒苷为标准品，探究出苯-乙醇（9∶1）为提取溶剂的铃兰毒苷提取纯化工艺，但溶剂中苯为第一类致癌物质，且工艺中溶剂消耗量大、萃取时间长，并只针对铃兰毒苷一种强心苷设计提取工艺，可能导致其他有效强心苷因此流失。因此，笔者结合超声波提取，采用毒性较低的乙醇、乙酸乙酯、石油醚、水等溶剂，通过单因素实验、多因素实验探究最佳提取条件，确定80%乙醇作为提取溶剂，料液比1∶10、超声提取时间120min、提取温度70℃为铃兰总强心苷最佳提取工艺。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

I3型紫外-可见分光光度计（海能仪器）；KQ-100DE超声波清洗机（昆山市超声波仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；分析天平（梅特勒-托利多）。

地高辛标准品（东京化成工业株式会社）；乙醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）、苦味酸等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 材料

实验所用材料为铃兰（Convallaria keiskei Miq.）的全草，产自辽宁抚顺。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系 取地高辛标准品0.0100g，加60%乙醇溶解并定容至25mL制成标准液。量取标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，60%乙醇定容至1mL，每种浓度标准液加入Baljet试剂（1%苦味酸溶液与1mol·L-1NaOH溶液按照95∶5体积比混合）4mL，摇匀，室温避光反应30min，在495nm波长下测吸光值[6，7]，得回归方程y=3.1043x+0.0211，R=0.9994，说明地高辛标准品在0～0.24mg·mL-1的浓度下有良好线性关系。结果见图1。

图1 标准曲线图Fig.1 Standard Curve

2.1.2 样品溶液制备方法 铃兰全草粉碎，过100目筛，称取2.0000g，20mL 60%乙醇30℃超声提取3次，每次超声提取30min，过滤，旋转蒸发回收乙醇，残液加10%Pb（Ac）2溶液2mL沉淀过滤去除色素，加饱和K2SO4溶液2mL沉淀多余的Pb（Ac）2，乙醇定容至25mL（乙醇终浓度为60%），取0.5mL加60%乙醇定容至1mL即为样品溶液。

2.1.3 精密度实验 取标准液0.45mL，60%乙醇定容至1mL，按2.1.1中方法重复6次测定吸光值，测定结果见表1。

由表1可见，吸光值的RSD为0.11%，说明仪器精密度良好。

表1 精密度实验结果Tab.1 Result of precision experimental

2.1.4 稳定性实验 量取2.1.2中样品溶液1mL，按2.1.1中方法显色，每隔5min测一次吸光值，测定测定结果见表2。

表2 稳定性实验结果Tab.2 Result of stability experimental

由表2可知，吸光值RSD为1.78%，说明30～55min内吸光值较稳定。

2.1.5 重复性实验 量取6份2.1.2中样品溶液1mL，按2.1.1中方法测定吸光值，测定结果见表3。

表3 重复性实验结果Tab.3 Result of repetitive experimental

由表3可知，吸光值RSD为0.95%，说明该法重复性良好。

2.1.6 加样回收实验 称取一定量已知含量的铃兰全草样品6份并加入一定量地高辛标准品，按2.1.2中方法制备样品液，按2.1.1中方法测定吸光值，计算回收率，测定结果见表4。

由表4可知，平均回收率为98.48%，RSD为2.06%[8]。

表4 加样回收实验结果Tab.4 Result of recovery experimental

2.2 溶剂种类对总强心苷提取率的影响

称取2.0000g铃兰粉末8份，分别加入乙醇20mL，浓度分别为20%、40%、60%、80%和无水乙醇，石油醚-乙酸乙酯（1∶9）、乙酸乙酯、水，30℃超声提取3次，每次30min，过滤，旋转蒸发回收溶剂，按2.1.2中方法制备样品液，取1mL样品液按2.1.1中方法测定吸光值，测定结果见图2。

图2 溶剂种类对总强心苷提取率的影响Fig.2 Effect of solvents type on extraction rate

由图2可知，说明80%乙醇为最佳提取溶剂，因此，选择80%乙醇做进一步优化实验。

2.3 料液比对总强心苷提取率的影响

称取2.0000g铃兰粉末10份，分别加入4、5、6、7、8、9、10、11、12、13倍量80%乙醇30℃超声提取3次，每次超声提取时间为30min，过滤，旋转蒸发回收溶剂，按2.1.2中方法制备样品液，取1mL样品液按2.1.1中方法测定吸光值，测定结果见图3。

由图3可知，1∶11为最佳料液比，因此，选择1∶11料液比做进一步优化实验。

图3 料液比对总强心苷提取率的影响Fig.3 Effect of liquid to material ratio on extraction rate

2.4 时间对总强心苷提取率的影响

称取2.0000g铃兰粉末6份，加入11倍量80%乙醇30℃超声提取3次，每次超声提取时间分别为30、60、90、120、150、180min，过滤，旋转蒸发回收溶剂，按2.1.2中方法制备样品液，取1mL样品液按2.1.1中方法测定吸光值，测定结果见图4。

图4 提取时间对总强心苷提取率的影响Fig.4 Effect of time on extraction rate

由图4可知，120min为最佳提取时间，因此，选择120min做进一步优化实验。

2.5 温度对总强心苷提取率的影响

称取2.0000g铃兰粉末6份，加入11倍量80%乙醇分别在30、40、50、60、70、80℃下超声提取3次，每次超声提取时间为120min，过滤，旋转蒸发回收溶剂，按2.1.2中方法制备样品液，取1mL样品液按2.1.1中方法测定吸光值，测定结果见图5。

由图5可知，随着温度升高提取率也不断增大，70℃提取率最高，但80℃迅速下降，可能是温度过高导致部分强心苷水解。

图5 提取温度对总强心苷提取率的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

2.6 正交实验

2.6.1 正交实验因素水平表

根据上述单因素实验设计L9（33）正交实验以探究各因素对总强心苷提取率的影响，表5为各因素水平。

表5 正交实验各因素水平表Tab.5 Level table of each factor in orthogonal experiment

2.6.2 正交实验结果及分析

正交实验设计和方差分析由SPSS 23软件完成。结果中P＜0.05具有统计学意义。正交实验结果见表6。

表6 正交实验结果Tab.6 Result of orthogonal experiment

由表6可知，温度是影响总强心苷提取率的主要因素，其次为时间及料液比，且计算优选水平组合与实验中最优水平组合相吻合，即最佳因素水平组合为料液比1∶10时，70℃条件下提取120min。

表7为正交实验方差分析结果。

表7 正交实验方差分析结果Tab.7 Result of variance analysis in orthogonal experiment

由表7可知，温度对提取率的影响达到了显著水平，时间和料液比没有达到显著水平，故实际提取过程中应注意对温度的控制。

3 结论

（1）单因素实验所用溶剂中，以80%乙醇提取效果最好，40%、60%乙醇次之，最佳提取条件为料液比1∶11，70℃超声波提取3次，每次120min，此条件下制得的样品液吸光值为0.638，换算为铃兰药材中总强心苷含量为0.25%，与文献[9]中报道的0.2%含量基本相符。

（2）正交实验结果表明，最佳提取条件为料液比1∶10时，70℃条件下提取120min，重复3次，而单因素实验中料液比最佳条件是1∶11，但根据正交实验结果可知，料液比这一因素对提取率的影响不显著，因此，以正交实验结果为准。

相比于陈玉昆等人使用苯-乙醇（9∶1）提取48h，本工艺通过超声波辅助，将原48h的提取时间缩短为6h，显著提高了萃取效率，且使用了低毒的80%乙醇代替了价格较高的含苯有毒溶剂，减少有毒溶剂对操作者的危害。但根据2.5中温度对提取率影响实验结果可知，温度到达80℃时提取率迅速下降，原因可能是提取溶剂中含水，高温导致强心苷内酯环水解，故实际提取温度不宜过高。综上所述，本工艺具有高效、环保、低成本等优点，适用于工业生产。