慢性乙型肝炎治疗性疫苗的研究现状及展望

冯天同，朱传龙

0 引 言

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，全球约2.57亿慢性HBV感染者中，每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病[1]。目前用于慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)抗病毒治疗的干扰素或核苷(酸)类似物，仅能抑制病毒复制，不能将共价闭合环状DNA从肝细胞内彻底清除，患者仍有进展为肝癌的风险。宿主的自身免疫，被认为是清除HBV的关键[2]，然而，随着感染的慢性化，患者往往表现出对HBV蛋白的免疫耐受，无法产生中和性抗体及有效的CD8+T细胞应答[3]。治疗性疫苗通过刺激抗病毒效应细胞，打破免疫耐受，激发对HBV的特异性免疫反应，有望取代目前的抗病毒治疗策略，实现CHB的临床治愈。

1 进入临床试验的疫苗

1.1 GS-4774GS-4774由表达乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙肝核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)和乙肝病毒x抗原(hepatitis B virus x antigen,HBxAg)的重组热灭活酵母构成，其酵母成分能够作为天然佐剂促进慢性乙肝感染中的T细胞反应。在小鼠模型及Ⅰ期试验中，GS-4774能够诱发HBV抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞的反应[4-5]。Lok等[6]进行的Ⅱ期研究结果显示，该疫苗并不能显著降低血清中的HBsAg水平。Boni等[7]进行的Ⅱ期研究，将单替诺福韦治疗与替诺福韦加GS-4774治疗设为对照，得到了同样的结论，各组患者的HBsAg平均水平在治疗后均无明显下降。不过，合并GS-4774治疗的组中HBV特异性CD8+T细胞表达IFN-γ、TNF-α和IL2显著增多，如何增加该疫苗的抗病毒作用仍需进一步的研究。

1.2TG1050TG1050是一种基于腺病毒血清型5的疫苗，其编码的融合蛋白包含截取的HBV核抗原、修饰过的聚合酶和富含T细胞表位的表面抗原包膜结构域。最近的一项Ⅰb期安慰剂对照试验，选择了正在使用NAs治疗的患者，随机接受109，1010，1011病毒含量的疫苗接种；各剂量(尤其是1010)的TG1050均诱导针对1～3个编码抗原的产IFN-γT细胞，但在研究结束时患者的HBsAg水平只有较小的降低[8]。

1.3HB-110基于pGX10载体的HB-110疫苗含有5个不同的质粒并编码大多数的HBV抗原。27位韩国患者随机接受了单独阿德福韦酯治疗或阿德福韦酯合并HB-110疫苗治疗[9]，在合并疫苗治疗的18例患者中仅5例观测到HBV特异的产IFN-γ T细胞反应，仅3例在研究结束时获得了乙肝e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的血清学转换，而改进前的HB-100疫苗在先前针对白种人的临床试验中使一半的患者取得了HBeAg血清学转换[10]。这可能与亚洲患者垂直感染的比例更大，有着更高的免疫耐受性相关。

1.4NASVACNASVAC(HeberNasvac)是目前最有潜力的乙肝治疗性疫苗，由HBsAg与HBcAg组成。在先前的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，其安全性及抗病毒效能均得到了有力的验证[11]。近期进行的NASVACⅢ期临床试验，纳入了160例CHB患者，并随机接受干扰素或NASVAC治疗。治疗结束时，NASVAC组与干扰素治疗组HBV DNA低于检测下限(250 copies/mL)的患者比例无显著差异(59.0%vs62.5%,P>0.05)，但在治疗结束24周后，NASVAC组HBV DNA水平低于检测下限的患者比例显著高于干扰素治疗组(57.7%vs35.0%,P<0.01)[12]。此外，经NASVAC治疗患者HBeAg清除率更高，进展为肝硬化的比例也更小。

2 新疫苗的研发

2.1 基于HBxAg的疫苗Horng等[13]融合了HBxAg与绿脓杆菌外毒素A，并通过大肠杆菌表达系统产出该重组HBxAg疫苗。在给HBV感染小鼠皮下注射HBx疫苗后可以观测到小鼠体内出现HBx特异性CD4+和CD8+T细胞反应，合并显著的HBsAg和HBV-DNA消除。在没有额外加强免疫的情况下，这种保护效果持续了至少30 d，显示了HBx作为免疫原制作治疗性疫苗的潜力。

2.2自噬体疫苗在Xue等[14]的研究中，通过处理过的包含HBV全长DNA的HepG2.2.15或HepG细胞与用来包含短寿缺陷核糖体产物的自噬体制作了基于自噬体的HBV治疗性疫苗。该疫苗可以诱导多层面的免疫反应，应用于急慢性HBV小鼠模型中该疫苗后均能观察到HBsAg和HBcAg特异性T细胞的增加，及HBV复制及HBcAg表达的减弱。

2.3病毒载体疫苗已有研究证明了基于重组野生型水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的HBV疫苗能够诱发小鼠的免疫反应[15]。但VSV因其不良的致病性，不能直接应用于人类。Moshkani等[16]制作了表达HBV表面中蛋白(middle hepatitis B surface protein,MHBs)的高减毒VSV，在显著减少致病性的同时依旧能在持续HBV复制的小鼠中引出MHBs特异性CD8+T细胞反应，减少血清和肝中的HBV抗原含量。

MCMV中的M27基因编码一种以转录因子STAT2为标靶的强力IFN拮抗物，能通过Cullin环泛素连接酶与蛋白酶体诱导STAT2降解，缺乏该基因的病毒突变体高度减毒且保留了复制能力。Huang等[17]将包含乙肝病毒表面小蛋白编码序列的表达组件插入缺乏m27基因的MCMV基因组中，并接种小鼠，使小鼠肝内HBsAg特异性CD8+T细胞反应增加并造成HBV清除。

2.4B细胞表位的疫苗Zhang等[18]创建了一种源自圆叶蝙蝠HBV核心抗原(RBHBcAg)的免疫增强病毒样颗粒载体(CR-T3)，用于显示HBsAg-aa119-125的肽中治疗效果最显着的的HBsAg-aa113-135(SEQ13)，制成候选分子CR-T3-SEQ13，并在小鼠中成功介导了HBsAg清除，长期抑制HBV转基因小鼠中的HBsAg和HBV DNA，并彻底根除HBV携带小鼠中的病毒。该疫苗基于独特的B细胞表位，对HBsAg的抑制作用与抗-HBs水平密切相关，表明其治疗的主要机制是依靠体液免疫反应诱导SEQ13特异性抗体应答实现。

2.5融合CD40配体的疫苗Zheng等[19]以HBeAg为目标抗原，将HBV的C(472-507)基因序列和人CD40配体的胞外结构域的融合序列连接到pEGFP-N1载体上，构架出重组质粒pEGFP-N1-C(472-507)-ecdCD40L。用该质粒转染人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC)后可以检测到其增强了共刺激分子(CD80、CD86、HLA-DR)的表达及细胞因子IL-12、p70的分泌，诱导了异源淋巴细胞的扩增。

Wu等[20]的研究中则是融合HBV S基因与人CD40配体的胞外结构域并与pcDNA3.1连接,通过肌肉注射用该质粒免疫乙肝转基因小鼠后同样可以观察到的DC成熟分化和功能提高，该结果可能与激活了DC中的TLR4有关。

2.6基于preS1的疫苗preS1结构域通过介导病毒与细胞受体的相互作用帮助HBV进入肝细胞，在HBV病毒颗粒的聚集和释放中起重要作用，CHB患者对preS1结构域有着较低的免疫耐性。Bian等[21]给感染HBV的小鼠接种preS1多肽疫苗，成功的诱发了抗-preS1免疫反应，造成小鼠体内preS1抗原水平急剧下降与HBV病毒颗粒清除，甚至减轻了对HBsAg的耐受状态。Chuai等[22]的研究发现，在给恒河猴接种DNA疫苗后，诱发出抗-preS1抗体的速度比抗-S和抗-C抗体更快，以preS1为抗原，可以更好地激发免疫应答。

2.7融合DNA疫苗Yu等[23]构建了编码与HBsAg相连的小鼠DEC-205单链可变区片段(mDEC-205-scFv)的质粒DNA疫苗。在HBV转基因小鼠中这种融合DNA疫苗诱导出强大的抗病毒T细胞和针对HBsAg的抗体免疫，下调了血清循环HBsAg的水平和HBV DNA拷贝数。Zhang等[24]研制出的质粒DNA疫苗则是编码与HBsAg相连的CD317单链可变区片段(α317scFv)，接种该疫苗的BALB/c小鼠血清循环抗-HBsAg抗体的水平达到了接种编码HBsAg对照疫苗小鼠的两倍，其致敏的脾细胞的细胞毒性比对照组高约3倍，从接种融合DNA疫苗的小鼠中分离出的脾脏淋巴细胞在体外被重组HBsAg再次刺激后显示出更强的增殖和表达IFN-γ能力。

2.8泛素化HBV抗原疫苗泛素在蛋白水解中作为信号分子，使靶蛋白被识别，并通过泛素-蛋白酶体系统降解。泛素化的抗原，已经被证明能有效地降解成抗原肽，并被主要组织相容性复合体MHCⅠ提呈，显著的增强抗原特异性CTL反应[25]。Dai等[26]设计并构建了由编码泛素化HBcAg慢病毒载体疫苗。接种LV-UB-HBcAg促进了IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌，产生高比例的产IFN-γCD8+T细胞和CD4+T细胞，并增强了HBV转基因小鼠体内HBcAg特异性CTL活性的增强。更重要的是，该治疗性疫苗能够打破免疫耐受，降低血清HBsAg、HBV DNA水平。此外，LV-UB-HBcAg能上调T细胞特异性T-box转录因子的表达，并下调脾T淋巴细胞GATA结合蛋白3的表达。

2.9纳米颗粒的疫苗纳米颗粒已经成为疫苗开发的一个重要平台，Wang等[27]设计了一种铁蛋白纳米颗粒疫苗，将preS1传递给SIGNR1树突状细胞(激活T滤泡辅助细胞)和与淋巴窦相关的SIGNR1巨噬细胞(激活B细胞)，诱导出高水平和持续的抗preS1反应，并在慢性HBV小鼠模型中实现了有效的病毒清除和部分血清学转。

2.10合成长肽疫苗DC在诱导T细胞反应中起关键作用。DC不仅能通过MHC II提呈外源性抗原激活CD4+T细胞，还能将抗原水解成短肽并通过MHC I激活CD8+T细胞[28]。合成长肽被设计来利用DC的这些独特能力。合成长肽的最适长度为20～45个氨基酸，同时包含CD8+和CD4+T细胞的表位。与短肽或DNA不同，合成长肽不由非专业抗原呈递细胞呈递病毒肽，而且，在体内由DC呈递的合成长肽抗原表位比从全蛋白呈递的抗原表位更有效，寿命更长[29]。Dou等[30]研究结果显示，基于HBcAg的合成长肽能被单核细胞来源的树突状细胞和BDCA1+髓样树突状细胞交叉提呈，并在体外显著增加自体HBcAg18-27特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞，在6/7的患者中，阻断PD-L1能进一步增加了合成长肽的作用。

3 疫苗佐剂的选择

疫苗佐剂是非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。适当的佐剂能帮助治疗疫苗有效的打破免疫耐受，提高抗病毒效能。在动物模型中，明矾[31]、皂苷[32]和CpG[33]已被证明可以提高乙肝疫苗的效力，除此之外，治疗人类疾病的药物或细胞因子等，也可以用作佐剂加强乙肝疫苗的免疫刺激作用。

3.1GM-CSF粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)能刺激和增强髓样树突状细胞的产生和激活，Zhao等[34]在疫苗接种前3天用GM-CSF对HBsAg转基因小鼠进行预处理，使HBsAg水平下降90%以上。在AAV8 -1.3型HBV感染小鼠中，该治疗方案完成后，血清HBeAg和HBsAg均被清除，HBV阳性肝细胞减少95%。该方案诱导了依赖CCR2的CD11b Ly6C单核细胞向CD11b CD11c树突状细胞转换，从而引发HBV特异性T细胞反应。

3.2poly(I:C)poly(I:C)是一种合成的双链RNA类似物，通过激活TRIF依赖的信号通路，诱发强烈的Ⅰ型IFN反应和抗HBV活性。Zhao等[35]将poly(I:C)作为HBV治疗性疫苗的佐剂(pHBV疫苗)，应用于HBV携带小鼠的治疗，发现pHBV疫苗能在体内和体外促进树突状细胞的成熟和抗原呈递能力，恢复耗尽的抗原特异性CD8 T细胞，有效、安全地降低HBV携带者小鼠的HBsAg和HBV DNA。此外，pHBV疫苗降低了Eomes的表达并增加了血清IL-12水平，进而促进了短寿命效应细胞的生成，从而在HBV清除中发挥了关键作用。

3.3T7-EAHu等[36]用由新型Toll样受体7激动剂T7-EA、明矾佐剂和重组HBsAg蛋白组成的HBV治疗疫苗接种小鼠，发现T7-EA刺激能局部细胞因子表达长达7 d。T7-EA可诱导Th1型免疫应答，打破免疫耐受，和传统的明矾佐剂乙肝疫苗相比，能增加正常小鼠中的HBsAg特异性IgG2a效价和T细胞应答。

除此之外，IL-22[37]、CS3[38]、K3-SPG[39]等在近年来相关研究中均被证明可以用作HBV治疗疫苗佐剂的候选物，增强疫苗的抗病毒效能。

4 增强疫苗效能的使用策略

4.1 异种初免-增强策略Chinnakannan等[40]使用了黑猩猩腺病毒(chimpanzee adenoviral,ChAd)和改良痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia virus Ankara,MVA)载体来编码多种HBV抗原(C、S和聚合酶抗原)。和单独应用ChAd疫苗相比，ChAd疫苗初次免疫后，加用MVA疫苗增强免疫，使T细胞应答的规模进一步增强，并分泌多种细胞因子。

Chuai等[41]研究发现，一些使用表达S(氨基酸[aa]1-223)和preS1(aa 21-47)融合抗原的颗粒疫苗(HBSS1)和/或重组腺病毒rAdSS1疫苗的接种策略，能够引出强大的HBV抗原特异性抗体应答。然而，仅HBSS1疫苗初免后rAdSS增强免疫的接种方式才能引起细胞免疫和高水平的细胞因子生成。此外，应用该疫苗接种程序的小鼠血清HBsAg、HBeAg和DNA的消失最快，有着更强的特异性CD4+和CD8+T细胞应答与更多IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12，及IFN-γ诱导蛋白IP-10的产生。

4.2鼻内接种尽管皮下注射是免疫接种中启动T细胞的经典途径，治疗性疫苗的接种的最佳免疫途径和合适剂量在很大程度上仍处于未知状态。Bourgine等[42]用包含HBsAg和HBcAg的重组疫苗通过鼻内(i.n.)、皮下(s.c.)或同时(i.n.+s.c.)3种方式接种小鼠。在所有动物模型中均检测到强于抗-HBs应答的对HBcAg的强抗体反应。携带HBV的小鼠模型中，抗-HBs反应主要是亚型特异性的，并优先由i.n.途径诱导，但其滴度并不足以清除小鼠血清中的高浓度HBsAg。在诱导细胞免疫反应，特别是CD4+T细胞方面，i.n.途径是最有效的。对于携带HBV的小鼠，仅在i.n.注射免疫后，肝内出现高频率的HBV特异性CD4+T细胞，并分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α。肝中CD4+T细胞表达整合素CD49a的频率增加，表明了鼻内注射在细胞归巢过程中的作用。此外，在HBV携带小鼠中相对多剂量的免疫接种似乎是基于蛋白的免疫克服免疫耐受的先决条件。

4.3抑制HBV抗原表达Michler等[43]用针对HBV转录共同3'-末端的短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)抑制小鼠肝细胞中HBV的抗原表达，对照组的小鼠则是用恩替卡韦或非HBV特异性siRNA处理。各组小鼠均用异种初免-增强策略进行疫苗接种。结果显示，表达肝细胞特异性shRNA或皮下注射siRNA小鼠，HBV抗原、HBV复制和病毒血症水平明显降低。在HBV抗原水平低的小鼠中，疫苗诱导了HBV中和抗体产生，增加HBV特异性CD8+T细胞的数量和功能，但在应用恩替卡韦治疗的高抗原水平小鼠中并没有发生这一变化，证明了高滴度的病毒抗原是HBV造成机体免疫耐受、降低治疗性疫苗效力的一个重要原因。应用siRNA抑制HBV抗原表达并配合治疗性疫苗能有效增加效应T细胞的数量并清除病毒。

5 结论与展望

迄今为止进入临床试验评估的疫苗除了NASVAC外，大都未能取得理想的病毒抑制效果。近年来随着相关研究的增多，对治疗性疫苗认知的逐渐加深，基于新的平台或是抗原提呈方式的疫苗不断被开发出来，并在动物试验中展现出良好的治疗效果。但这些疫苗是否能同样安全有效地激活CHB患者免疫清除还需进一步的研究。激活患者的免疫系统以获得对HBV的持续控制是CHB免疫治疗的最终目标，有效的治疗性疫苗研发核心应放在打破机体的免疫耐受状态上，选择合适的目标抗原与提呈方式，以及使用合适的佐剂或优化疫苗应用策略均展现出不错的治疗潜力。