硬脑膜影响颅骨发育的机制研究进展

王孟辉，高 岩，韩建国，张春阳

[1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院神经外科疾病研究所(转化医学)；3.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心；4.深圳大学总医院]

脊椎动物中枢神经系统(central nervous system，CNS)被三层膜包裹，而在脑表面包裹的分别是硬脑膜、蛛网膜以及软脑膜[1]。其中硬脑膜是一种厚而致密的胶原膜，附着在颅骨的内表面。它由内外两层组成，外层的硬脑膜紧贴在颅骨下，相当于颅骨内表面的骨膜，硬脑膜外层又称骨膜层，含有大量丰富的血管，负责颅骨的血供，内层又称脑膜层，相较外层厚而坚韧，主要作用是保护大脑。近些年来，越来越多的证据表明脑膜积极参与大脑和颅骨的发育，尤其是硬脑膜对颅骨的形成过程中起着重要的调节作用，未成熟的硬脑膜细胞具有分泌生物因子促使成骨细胞为分化成为骨细胞，并且产生骨基质蛋白的能力[2]。因此本文仅围绕硬脑膜与颅骨发育之间的关系展开综述，通过总结硬脑膜影响颅骨发育的机制以期为今后颅骨发育的研究奠定理论基础。

1 硬脑膜与颅骨在胚胎发育时期的关系

许多研究人员已经在多种物种中描述了硬脑膜的胚胎发育，一些工作甚至可以追溯到200多年前，在本文我们将重点描述哺乳动物的过程，其中包括对人类、小鼠和大鼠以及绵羊的研究[3]。硬脑膜起源于发育中的大脑表面的间充质鞘，称为原发性脑膜，其具有明显的组织学特征。早期胚胎发育的过程中，间充质细胞在神经管关闭时开始包围后脑，并继续扩散到中脑和前脑水平，这个鞘是最初期的发育体，它是脑膜、头骨和头皮产生的原基[4]。随后，在小鼠发育的E10.5阶段，初级原基被划分为一个外部致密层和一个内部网状层，内层被认为是脑膜间充质。 在人类第17卡内基阶段(怀孕第六周)和小鼠E13阶段，大脑周围的间质被组织成多个不同的层，最外部的层是胚胎真皮层，下一层是所谓的生骨层，因为它产生了颅骨[5]。内层被认为是脑膜间充质层,硬脑膜中的淋巴管在出生后早期发育形成[6]。从细胞起源上来说，外胚层水平产生的神经嵴衍生细胞有助于与前脑相关的脑膜，而中胚层衍生的细胞产生中脑和后脑的脑膜以及所有脑膜的血管内皮细胞[7]。 但是值得注意的是，颅骨及骨缝也是来源于中胚层与神经嵴细胞。江晓兵等人通过使用一种转基因小鼠，用一种在神经嵴细胞中表达的基因Wnt1，其中编码Cre酶的基因被置于Wnt1启动子的控制之下， 通过这个实验，得出结论额骨主要由神经嵴衍生细胞组成，中胚层细胞的贡献较小，而顶骨完全由中胚层细胞组成[8]。 由此可见，在胚胎发育的过程中，硬脑膜与颅骨发育的关系如此紧密。由于颅骨和脑膜形成紧密的结合，预计这两种结构在发育过程中会有广泛的调节相互作用，因此，关于硬脑膜对发育时期的颅骨及骨缝的融合过程中的影响颅骨发育的生物因子开展了广泛的研究。

2 硬脑膜上影响颅骨发育的生物因子

众所周知，各个颅骨在发育的早期是不相互连接的，但是各片颅骨之间都有共同的附着点，那就是硬脑膜，各个颅骨之间的硬脑膜完整是非常重要的，因为多种分泌分子，包括转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族成员，它们都在硬脑膜中表达，并被认为介导与颅骨的相互作用。在早期研究中的Douglas A. Roth等人通过将额骨骨缝周边的硬脑膜通过硅胶片隔离开来的方式发现，当硬脑膜缺损或者有障碍物将硬脑膜骨缝周边的颅骨隔离开来的时候，颅骨的发育就会延迟，骨缝闭合时间就会变短[9]。这些研究共同表明，硬脑膜对颅骨后期发育的钙化模式和形态形成具有指导作用。关于硬脑膜分泌分子与颅骨发育之间的关系，主要有以下几个方面的研究。

2.1TGFβ信号通路与颅骨发育之间的关系 转化生长因子β(TGFβ)超家族由TGFβs、激活素和骨形态发生蛋白(BMPs)组成。其中 TGFβs和BMPs已被证明可以调节膜性成骨再生在骨骼发育过程中，TGF-β信号促进神经嵴细胞增殖，同时抑制成骨分化[10]。其中TGFβs家族成员参与了成骨细胞活动和代谢方面调控[11]。在细胞间信号通路中，有直接证据表明，转化生长因子β(TGFβ)信号是硬脑膜正常发育所必需的，编码其受体的tgfbr2从早期就在脑膜间充质中表达，而且促进了骨生长和成骨细胞的合成代谢功能[12]。研究发现了TGF-β1在体外对人成骨细胞细胞系(HCEM)增殖和分化的影响，它确实促进了HCEM细胞的细胞分化和矿化[13]，而且当体内局部注射转化生长因子-β同工型(TGF-β1，β2和β3)时，发现其在骨骼中含量很高，并刺激颅骨的形成。额后缝融合期间存在强烈的免疫反应性成骨细胞，矢状缝仅具有轻微的免疫反应性。在TGF-β同工型之间观察到了不同的免疫染色模式，相比而言TGF-β2是最具有免疫反应性的同工型，也与硬脑膜和融合骨缝边缘的成骨细胞密切相关[14]。Arun K Gosain等人利用逆转录酶聚合酶链反应作为检测小鼠颅骨组织中TGF-β1、TGF-β受体1(TGF-βR1)表达的方法，这些结果表明，在骨缝间充质和硬脑膜之间存在TGF-β1、FGF-2及其受体的组织特异性mRNA表达[15]。HanJoon M Song等人通过用复制缺陷型腺病毒去编码出有缺陷的显性的负性II型TGF-β受体(AdDN-TbetaRII)从而阻断TGF-β信号传导，发现其可以抑制后额缝合融合[16]。这些研究的观察结果表明，硬脑膜-骨缝的相互作用可能通过硬脑膜来源的生长因子以旁分泌的方式发出信号。这些肽反过来刺激附近的成骨细胞，从而产生促进骨生长的因子，例如骨钙蛋白，从而影响骨缝的闭合以及后期颅骨的生长与修复。TGF-β信号在调节膜性成骨过程中促进神经嵴细胞增殖，抑制成骨分化，并且在颅骨发育过程中促进了成骨细胞的合成代谢，促进了成骨细胞系的分化与矿化，同时其对于颅骨发育后期骨缝闭合具有重要的作用。

2.2骨形态发生蛋白BMP与颅骨发育之间的关系 骨形态发生蛋白(BMPs)是转化生长因子 β(TGF-β)超家族中的重要成员之一，是骨骼发育的重要生长因子，骨形态发生蛋白BMP家族在骨缝中的表达模式以及调节其体外表达的因素有着重要的作用[17]。其中将BMP-2修饰并掺入水凝胶中有增强MC3T3-E1成骨细胞的成骨作用[18]，应用BMP-2 与功能化巴基管复合仿生材料修复兔颅骨缺损的实验研究发现，硬脑膜中提取的BMP-2结合的碳纳米材料对于颅骨修复具有良好的作用，BMP-2多肽通过形成类似与蛋白共价键原理，分别通过羧基和氨基这两种官能团与巴基管结合，BMP-2 多肽可通过与不同官能团形成共价键从而作用更长的时间[19]。Nacamuli RP对大鼠后额叶和矢状缝分别在不同的时间进行了基因微阵列分析。应用RT-PCR反应来分析基因的定量表达，先是使用由重组人成纤维细胞生长因子2或重组人转化生长因子β1刺激的原代大鼠的颅骨成骨细胞，或与原代大鼠非骨缝处的硬脑膜一起培养，确定其对BMP-3表达的定量调节。在所分析时间的过程中，后额缝中BMP-3的表达下降，而矢状缝中BMP3的表达则增加[20]。BMP-3可增强MSC(人间充质干细胞)增殖和分化，比如增加的细胞数量和特定基因表达，这些作用可能与TGF-β信号传导途径的激活有关[21]。 而核酸酶Cas9(CRISPR-Cas9)技术对MSC间充质干细胞进行基因表达用以表达骨形态发生蛋白9(BMP-9)，然后对进行体外培养大鼠颅骨缺损的成骨细胞应用，发现成骨细胞的潜能和胞内骨形成增强，发现核酸酶Cas9技术生成的过表达的MSC间充质干细胞注射治疗的大鼠颅骨缺损显示出明显增加的骨形成和骨矿物质密度，BMP-9表明可有效增强骨骼形成[22]。而且，在BMP家族中，目前只有BMP-9具有抵抗硬化蛋白Noggin诱导对Smad细胞信号通路抑制的特性[23]，而且使用BMP-9的体外和体内研究已经证明了它对成骨的有效性，因此BMP-9被认为是BMP家族中最有可能刺激骨祖细胞分化成为骨细胞的成员之一[24-26]。总之，在BMP家族中，BMP-2具有促进成骨细胞成骨及矿化的作用，加之其与骨组织仿生材料较易结合，且不易失活，因此，BMP-2在目前的骨组织工程方面的较为广泛，BMP-3增强可能与TGF-β信号传导途径的激活有关的人间充质干细胞增殖和分化，而BMP-9具有抵抗Noggin对Smad细胞信号通路抑制的特性，因此这也是关于BMP家族研究的热点之一。

2.3雄激素与颅骨发育之间的关系 长期以来，雄激素在骨颅发育和骨量维持中起着非常重要作用[27]。相较于血清雄激素水平正常的男性，雄激素缺乏症的男性骨密度相对较低，并且骨吸收能力也相对有所增加[28]，而且对人和小鼠衍生的成骨细胞和成骨细胞样细胞系的体外研究表明，在培养基中添加睾酮或5-二氢睾酮会刺激颅骨硬脑膜细胞和成骨细胞的增殖和分化。分离并培养原代鼠胚胎(E18)硬脑膜细胞和颅骨成骨细胞,用雄激素刺激硬脑膜细胞和颅骨成骨细胞，通过非放射性增殖测定法去检查细胞的增殖。发现雄激素刺激使胎儿硬脑膜细胞及颅骨成骨细胞的增值都有一个明显的增加，但硬脑膜细胞增加更为显著。雄激素刺激增加了颅骨成骨细胞碱性磷酸酶和TGF-β1的表达，所以雄激素刺激胎儿硬脑膜和成骨细胞从而促进细胞增殖和成骨细胞分化，并能诱导骨缝融合[29]。雄激素信号传导可能通过硬脑膜细胞分泌及信号通路的促进骨分化来刺激骨缝壁成骨，雄激素的增加会刺激颅骨成骨细胞的增殖，而且运用雄激素阻滞剂的情况下会降低成骨细胞的成骨潜能[30]，这也可能是先天性颅骨畸形不同性别患病率差异的原因。雄激素信号对于不同谱系成骨细胞分化的影响程度不同，在神经嵴起源的细胞中被增强，而在中胚层起源的细胞中被抑制。雄激素在体内的复杂作用，这种作用可能细胞的胚胎谱系和发育起源有关[31]。 雄激素在骨颅发育和骨量维持有着重要作用，通过刺激颅骨成骨细胞碱性磷酸酶和TGF-β1的表达从而促进细胞增殖和成骨细胞分化，而且对于不同谱系成骨细胞分化的影响程度不同，这与可能颅骨胚胎的起源有关。

2.4FGF与颅骨发育之间的关系 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)信号通路已被证实在调节颅面骨的神经嵴细胞诱导、迁移和分化成骨过程中起着重要的作用[32]。在膜性成骨形成过程中，FGF信号调节几种关键的成骨转录因子，如Msx1、Msx2和Runx2等等，在颅骨发育过程中，FGF信号调节成骨细胞的分化，促进骨缝闭合，以及FGF信号的突变导致颅缝滑闭，从而导致骨缝的过早融合[33]。但是，也有研究表明，FGF对于颅骨调节可能是阶段性的，FGF信号突变被证明是促进成骨细胞过早的分化以及功能的增加，但是成纤维细胞生长因子受体FGfr2的突变，也观察到成骨细胞凋亡的增加，导致颅骨滑闭[34]。同时Kanda等人发现大鼠骨髓细胞在FGF培养基中培养后，细胞数量显著增加，BMP2 和骨桥蛋白等成骨相关蛋白表达明显增加，推测FGF与BMP2中间可能有着协同的作用[35]。Gromolak Sandra等人FGF-2和BMP-2处理的绵羊骨髓细胞(BM-MSC)保持其最初的MSC特性并改善了其成骨分化能力，发现了骨钙素和I型胶原的表达增加以及成骨相关基因标记BMP-2，Runx2，osterix的表达上调。此外，绵羊BM-MSCs产生了多种与成骨有关的生物活性因子，与此同时补充了FGF-2和BMP-2的培养基会影响细胞的分泌组特征。所以绵羊成骨诱导的BM-MSCs可以用作细胞疗法[36]。而且最新研究表明，Apert综合征患者的颅面畸形成因与成纤维细胞生长因子受体2基因方面的突变具有密切的关系，使用FGF治疗Apert综合征的基因治疗对于骨缝融合和通畅的调节与至关重要，靶向FGF / FGFR信号的生物疗法对于治疗 Apert综合征所导致的颅面畸形可能会有一个更好预后效果[37]。成纤维细胞生长因子信号通路在调节颅面骨的神经嵴细胞诱导、迁移和分化成骨过程中起着重要的作用，但是这种作用可能是可能是阶段性的，促进成骨细过早分化会导致颅缝的早闭，并且其表达上调可以引起BMP2 和骨桥蛋白等成骨相关蛋白表达明显增加，这也表明了FGF与BMP2中间可能有着协同的作用。

3 小结与展望

硬脑膜与颅骨发育及其代谢过程有着密切的关系，无论是在早期胚胎发育时期，还是在后来的颅骨发育形成、骨缝闭合的过程中，甚至是成年之后颅骨的缺损与修复的过程里，硬脑膜及其上面分泌的生物因子都起着非常重要的作用，这种作用可能与胚胎发育时期的细胞谱系以及发育起源有关，而且在后期的发育过程中，硬脑膜上的分泌因子可能通过旁分泌的方式诱导成骨细胞及破骨细胞对于颅骨形态以及骨缝的闭合与否产生介导作用，这些生物因子相互作用，相互影响，对于颅骨的矿化以及代谢，维持骨稳态起着至关重要的作用。

此外，尽管目前对与硬脑膜与颅骨发育相关生物的研究较多，也取得了一些重要的研究成果，但对于硬脑膜上调控颅骨发育的分子机制仍未十分清晰。随着未来研究的不断深入，在不远的将来能够了解硬脑膜上分泌的生物的因子的完整机制，而且阐明这些生物因子之间的相互作用，才能为未来骨组织工程学以及转化医学指明研究方向，并且为未来的临床上颅骨骨缝过早闭合引起的头颅畸形以及颅骨缺损与修复奠定理论基础。