颧骨种植体支抗后牵引猴上颌骨骨缝反应的组织学定量研究＊

余 蕾， 张晓蓉， 邓 婕

1四川省自贡市第四人民医院口腔科，自贡643000

2昆明医科大学附属口腔医院正畸科，昆明650031

骨性上颌前突不仅影响口腔健康、功能、面部美观，而且随着生长发育，畸形可能会逐渐加重，对患者的生活和社交均产生负面影响，甚至导致心理疾患。对于早期骨性上颌前突，有效地后牵引抑制过度生长的上颌骨是获得最佳正畸疗效的关键之一［1］。目前，临床上治疗骨性上颌前突的方法主要是利用头帽口外弓，但其疗效依赖患者的合作［2］。近年来，种植体技术的迅猛发展，种植体被作为较理想的支抗装置引入正畸临床。目前，将种植体作为矫形支抗的研究多数集中在前牵引上颌骨和腭中缝开展上，针对后牵引上颌骨抑制其生长的研究还很少。Sheridan等［3］认为颌骨的矫形治疗中，矫形力主要通过调控颅面复合体的骨缝生长来影响骨改建。Mao等［4－5］研究发现骨缝反应是以几个组织学变化为特征，包括：骨缝宽度的变化、骨缝区细胞密度的变化和骨缝成骨前沿的骨生成，而其中的骨缝宽度变化最为重要。本实验通过定量分析骨缝宽度和细胞密度的变化，研究后牵引力作用下上颌骨相关骨缝反应，深入探讨种植体支抗后牵引抑制上颌骨生长的矫形作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料

云南产青春生长发育期（约3岁，按照Hellmen牙龄的划分，牙龄为ⅢA～ⅢB，牙列完整、牙周健康）、雄性、SPF级（清洁级，即无特定病原体动物）恒河猴4只；颧骨种植体支抗系统（慈北公司，浙江）；牙弓夹板（家鸿齿科，昆明）；Motic Med 6．0数码医学图像采集系统（MOTIC公司，Japan）；Image Pro Plus 6．0图像分析系统（Media Cybernetics公司，USA）；玻璃离子（3MUntitek公司，USA）；梯度乙醇、EDTA、4%多聚甲醛、二甲苯、苏木精和伊红。

1．2 方法

1．2．1 动物模型的建立 肌注复合型氯胺酮（0．1 mg／kg）麻醉恒河猴，在上颌第一磨牙远中根方前庭沟作垂直切口，依次切开黏膜、肌肉和骨膜，剥离骨膜并暴露颧骨，用引导钻钻开骨皮质，将钛板植入，用3枚微螺钉固定在颧骨体部，分层缝合肌肉和黏膜，将钛板末端牵引钩暴露于前庭沟底部。按照铸造冠备牙要求进行牙体预备，去除上颌第一恒磨牙、第二乳磨牙及切牙牙体倒凹，牙弓夹板试戴后，采用玻璃离子粘接于上颌牙弓。Ni－Ti螺旋拉簧一端结扎固定在种植体末端拉钩上，另一端通过结扎丝与牙弓夹板上的牵引钩结扎；用正畸测力计测量拉簧力值，使单侧拉簧产生150g牵引力，双侧共计300 g，力的方向与 平面平行（图1）。

图1 动物模型的建立Fig．1 Establishment of the animal model

1．2．2 骨缝标本的制备和染色 分别于实验1．5个月、3个月肌注氯胺酮麻醉后，4%多聚甲醛（PFA）行双侧颈总动脉灌注、固定、股动脉放血处死实验猴3只、对照猴1只。动物处死后，取下完整颅骨标本，去除脑组织。采用4%多聚甲醛进行24h固定后，取出标本。将各骨缝：颧颞缝、颧颌缝、颧额缝、额颌缝、蝶颧缝、翼腭缝、腭中缝、横腭缝分别游离，采用甲酸脱钙1个月左右，至针尖可以刺破骨皮质，终止脱钙。自来水24h漂洗过夜，梯度乙醇慢脱水，氯仿透明，浸蜡，常规石蜡包埋，与骨缝界面垂直做连续切片，片厚4μm，裱于经多聚氨酸（Poly－L－Lysine）处理的载玻片上。从切到骨缝组织开始，对切片进行连续编号，每个标本选择相同编号且连续的5张切片进行组织学染色。常规苏木精－伊红染色，中性树脂封片。

1．2．3 图像的采集和分析 应用 Motic Med 6．0数码医学图像采集系统对图像进行观察并采集图像。同时使用Image Pro Plus 6．0图像分析系统对实验组和对照组各阶段的骨缝宽度进行研究。40倍放大的图像，在观察视野内的骨缝上画圆，使每个圆的直径与骨缝宽度相等（图2），通过测量圆的直径可得到骨缝宽度。在100倍放大并且有标准格（110μm×110μm）的图像上随机选择6个包含骨缝区的标准格，对其内符合条件的细胞计数（图3），总的细胞密度用单位面积的细胞数表示（cells／mm2）。所有实验数据均采用均数±标准差（±s）表示，数据由SPSS 13．0统计软件处理，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

图2 骨缝宽度的测量（苏木精－伊红染色，×40）Fig．2 Measurement of the width of suture（HE staining，×40）

图3 细胞密度的测量（苏木精－伊红染色，×100）Fig．3 Measurement of cell density（HE staining，×100）

2 结果

2．1 骨缝宽度

观察对照组、1．5月组和3月组各骨缝宽度直条图（图4）可以发现，实验前后上颌骨周围各骨缝宽度均发生了不同程度的变化：在后牵引力作用下，颧颞缝、颧颌缝、横腭缝和翼腭缝骨缝宽度随着加力时间延长逐渐减小，其中，颧颞缝和翼腭缝1．5月组明显减小。额颌缝、颧额缝、腭中缝和蝶颧缝骨缝宽度随着加力时间延长逐渐增加，其中，颧额缝、额颌缝和蝶颧缝3月组明显增加。

图4 各组骨缝宽度Fig．4 The width of suture in different groups

若要进一步分析这种差异是否具有统计学意义，还需行统计学分析。经检验，表1所示数据均符合正态分布，故可进行方差分析。对照组、1．5月组、3月组经分析后，确定检验水准α＝0．05，由于均P＜0．05，差异有统计学意义。所以可认为对照组、1．5月组、3月组骨缝宽度总体上存在统计学差异。要比较具体两组间存在的统计学差异，还需进行两两比较。研究结果如表1所示，3月组和对照组相比，各骨缝宽度变化均具有统计学差异；在宽度减小的4条骨缝中，颧颞缝和翼腭缝1．5月组宽度明显减小，但是与3月组比较差异无统计学意义；而在宽度增大的4条骨缝中，额颌缝和蝶颧缝3月组宽度明显增大，与对照组、1．5组比较差异均有统计学意义，但是对照组和1．5月组差异无统计学意义。

2．2 细胞密度

通过对照组、1．5月组和3月组各骨缝细胞密度直条图（图5）的观察可以发现，实验前后各骨缝区细胞密度均发生了不同程度的变化：在后牵引力作用下，实验组细胞密度均大于对照组。其中，额颌缝、颧额缝、腭中缝和蝶颧缝细胞密度3月组大于1．5月组；而颧颞缝、颧颌缝、横腭缝和翼腭缝细胞密度1．5月组大于3月组。

表1 3组间骨缝宽度比较（±s，μm）Table 1 Comparison of the width of suture among three groups（±s，μm）

表1 3组间骨缝宽度比较（±s，μm）Table 1 Comparison of the width of suture among three groups（±s，μm）

与对照组比较，＊P＜0．05；与1．5月组比较，△P＜0．05

组别 额颌缝 颧额缝 颧颞缝 颧颌缝 横腭缝 腭中缝 翼腭缝 蝶颧缝．00 42．92±5．61 1．5月组 53．18±16．54 80．26±25．40＊ 73．51±30．37＊ 81．23±59．58＊ 72．02±20．66＊ 100．17±114．03＊ 53．43±12．15＊ 62．79±22．16＊3月组 197．01±55．96＊△197．01±55．96＊△ 66．24±14．61＊ 41．59±10．09＊△ 42．30±20．22＊△157．23±36．19＊△ 51．35±16．72＊ 195．04±72．15对照组 48．53±15．03 59．31±17．28 198．58±30．03 113．16±35．12 106．00±34．68 46．68±13．79 187．00±42＊△

图5 各组细胞密度Fig．5 Cell density in different groups

进一步对差异进行统计学分析后发现，1．5月组和对照组比较，所有骨缝细胞密度均增大，差异均有统计学意义（P＜0．05）；3月组和1．5月组比较，颧颌缝和翼腭缝细胞密度减小，但是差异无统计学意义，额颌缝和腭中缝细胞密度增大，但差异无统计学意义；3月组和对照组比较，颧颞缝细胞密度差异无统计学意义。

3 讨论

骨缝定量一直是学界难点，不仅因其自身结构复杂（骨的几何形状、骨缝走行方向和骨缝位置），还受技术限制。传统方法是在骨缝的某个特定区域两侧各植入一颗汞合金以评估骨缝宽度的变化［6－7］。但是，骨缝自身结构的复杂性决定了骨缝宽度在不同区域不是线性的［8－9］。计算机技术的飞速发展给定量分析带来了新的希望。有国外学者［10－12］率先利用计算机组织形态学技术定量分析了间断循环张应力和压应力作用下的骨缝反应。最初，他们采用在分析图片上建立一定大小的标准格将骨缝分割成若干个小的区域，再画圆，以圆的直径代表骨缝宽度，同时使圆的直径位于所建立的标准格的横轴或纵轴上。此方法为骨缝宽度的测量开拓了全新的模式，但也有明显的不足，即当骨缝的走行呈一定角度时圆的直径不一定能位于坐标轴上。随后，学者们进行了改进［13］：保留标准格和圆，同样以圆的直径代表骨缝宽度，但是不将直径放在坐标轴上，而是让圆位于标准格内。此举确实解决了因骨缝走行的差异而影响准确性的问题，但是要保证圆既完全位于标准格内又能代表骨缝宽度，那么符合这一要求的圆的数量将明显减少。建立标准格的目的是为了将走行不规则的骨缝划分成若干个小区域实现定量分析。标准格太大或太小都不能画出足够多满足条件的圆，不能实现定量。而本课题研究的8条骨缝因其各自的复杂性使同时适应于所有骨缝的标准格很难建立，而且定量的关键是要有足够的测量单元。所以在考虑了以上各种因素后，本研究舍弃标准格直接画圆来代表骨缝宽度，以保证圆的直径即骨缝宽度，同时不受骨缝走行和标准格大小的影响，更重要的是有足够的测量单元以实现定量分析。此法为骨缝定量分析开拓了全新的思路。

细胞密度的定量分析也可采用计算机组织形态学技术。国内方面，吴拓江等［14］在200倍放大的显微图像上随机选择3个视野，在定好的参数下测量颌间Ⅲ类矫形力作用下骨缝区细胞密度。该方法在测量视野、细胞种类的选择上存在不足。国外学者［10－12］则在已经建立有110μm×110μm标准格的20倍放大的显微图像上，随机选择6个包含骨缝区的标准格，对其内符合条件的细胞计数，即只计数骨缝内的非暂时性细胞，而非骨缝两端成骨前沿内细胞和血管内细胞如红细胞等一过性的细胞，定量分析了循环张应力和压应力作用下鼻额缝和前上颌缝骨缝细胞密度的变化。本研究采用国外学者的方法对8条骨缝细胞密度进行定量分析。

本研究发现，在后牵引力作用下，上颌骨周围的4条骨缝中，颧颌缝、翼腭缝和横腭缝骨缝宽度减小，呈压缩状态，提示上颌骨向后压缩。其中，颧颌缝作为上颌骨和颅骨连接面积最大、骨质最致密处，矫形力并非垂直，故其反应非常复杂，张强等［15］利用三维有限元法分析后也发现，颧颌缝上方（内、外侧）的拉应力较大，颧颌缝下方（内、外侧）的压应力较大。本研究中其宽度减小，可能是矫形力作用下上方牵引形变弱于下方压缩形变的结果。而位于上颌骨上部的额颌缝宽度增大，呈牵张状态，提示上颌骨同时伴顺时针旋转。这与Tanne等［16］采用三维有限元法研究在 平面向后牵引时鼻上颌复合体呈顺时针旋转的结论一致。但张晓蓉等［17］观察发现额颌缝呈吸收为主的骨缝反应。这可能是因为额颌缝结构复杂，部分呈现压缩，部分呈现牵张，但总体表现为牵张。张强等［15］也证实后牵引角度由＋30°～－30°，额颌缝应力分布均以拉应力为主。

作为种植体承载骨，颧骨周围的3条骨缝中，颧颞缝骨缝宽度减小，呈压缩效应；颧额缝、蝶颧缝宽度增大，呈牵张效应，提示颧骨具有一定的旋转趋势。这也是种植体支抗与口外弓抑制上颌骨生长不同之处，口外弓使上颌骨向前、向下的生长受到抑制，使下颌向前的生长受到促进，但是对于颧骨没有明显的影响［18］。此外，前期研究［17］指出颧骨周围的骨缝均呈现牵张拉伸状态。这可能与骨缝反应的复杂性及观察视野差异有关，有待进一步研究证实。

本研究发现腭中缝宽度增加，呈牵张状态，且随着时间延长效果更为明显。但张强等［19］研究发现向后牵引角度为＋30°、0°、－30°时在腭中缝前、中、后部的位移方向都是压迫。本研究采用的是与 平面平行，但与正中矢状面有一定夹角的牵引力（图6A）。牵引方向不同可能使骨缝同一部位出现不同的应变反应，骨缝宽度也出现差异。值得注意的是，张强等采用的是与正中矢状面平行向后的牵引力（图6B），力作用线近似平行，对于腭中缝而言就相当于骨折治疗中采用的夹板作用，限制了腭部的横向扩展；而本研究采用的力与正中矢状面形成了一定夹角，即从前段牙弓向后段牙弓呈现出外展的趋势，给予腭中缝从前向后不断加大的横向扩弓效应。

图6 与正中矢状面夹角不同的后牵引力Fig．6 Retractive force of different angles with the median sagittal plane

本研究发现8条骨缝细胞密度均为实验组大于对照组，可能由于应力作用下骨缝间质内的细胞增殖率增加或（和）凋亡率降低。现有研究亦发现骨缝区细胞密度的增加主要归因于间充质细胞的增加，而这一结果也已被间充质细胞对于机械应力的反应所证实［20］。从开始发育到成熟，骨缝均由5层结构加内外2层骨膜构成。压应力使5层结构受到不同程度的损伤，增生活跃的成骨细胞层最易受损进而变性，力量越大、时间越长变性越严重，因此总细胞活力明显下降甚至停止［21］。所以，1．5月组各骨缝细胞密度均增大，但随着牵引时间的延长，颧颌缝、翼腭缝、横腭缝和颧颞缝细胞密度减小，即3月组＜1．5月组，总体上呈现出一种受压缩的趋势。与此相反，张应力激活敏感细胞，细胞密度增加，此后随着作用时间延长，细胞继续增殖。所以，随着牵引时间的延长，颧额缝、蝶颧缝、额颌缝和腭中缝细胞密度增大，即1．5月组＜3月组，总体上呈现出一种受牵张的趋势，与骨缝宽度的变化一致。

此外，后牵引力作用下细胞密度变化具有一定时间差异。颧颌缝、翼腭缝、额颌缝和腭中缝在1．5月组和3月组间差异无统计学意义，并不表示这4条骨缝未受到矫形力作用。相反，可能由于这些骨缝早期就在矫形力的作用下而积极改建，细胞的增殖、分化和凋亡很快适应矫形力而达到动态平衡。颧颞缝在对照组和3月组间差异无统计学意义，可能的原因是持续压应力作用下，成骨和成纤维细胞大量受到抑制，合成细胞因子明显减少、甚至停止，破骨细胞激活明显减少、甚至停止，总的细胞密度明显减小，与对照组比较差异无统计学意义。此外，颧额缝、横腭缝细胞密度和骨缝宽度对照组、1．5月组和3月组间两两比较差异均有统计学意义，说明其细胞密度变化与骨缝宽度变化高度一致。翼腭缝细胞密度和骨缝宽度1．5月组和3月组差异均无统计学意义，说明在后牵引力作用下，早期骨缝就发生积极改建达到动态平衡。

综上所述，在颧骨种植体支抗后牵引矫形力作用下，上颌骨有向后压缩并伴顺时针旋转趋势；颧骨作为支抗承载骨也有一定的旋转趋势。与正中矢状面有一定夹角的后牵引力对上颌腭中缝有横向扩弓的效应。

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