角膜硬度的测量方法及与眼部疾病相关性研究进展△

蒲琪 马倩 李新宇

角膜是位于眼球最前端的透明、无血管、有弹性的纤维膜，既是眼部屈光力最大的组织，又是关键的屏障结构。正常情况下，角膜维持着相对稳定的生物力学特性，包括硬度、弹性、黏滞性等。组织硬度是角膜研究的最广泛的生物力学指标，参与形成角膜屈光功能、保持眼球稳定并维持眼表健康。为全面认识角膜硬度的测量方法及与眼部疾病相关性的研究进展，本文就角膜的生物力学特点和角膜硬度的测量、影响因素、应用进展进行综述。

1 角膜的结构和生物力学特性

生物力学是在微观和宏观层面上研究作用于生物体内部和之上的力的起源和作用的科学[1]。考虑到角膜的屈光功能及屏障支持功能，研究角膜的生物力学将有助于人们更科学地认识和管理相关眼部疾病，深化对青光眼患者的眼压测量、屈光手术的设计和随访、圆锥角膜(keratoconus,KC)的诊断和随访等临床诊疗操作的认知。角膜的生物力学特性主要包括角膜硬度、张力、弹性、黏滞性及其他未被定义的因素[2]。其中，硬度是评估角膜生物力学特性最重要且最常用的指标之一，借用机械工程学中的术语可称其为弹性模量，它描述了在特定条件下载荷使角膜变形的程度，弹性模量越大，角膜越硬[1]。

角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层组成。其中，基质层占角膜厚度的90%，由胶原纤维(Ⅰ型和Ⅳ型胶原)、角膜基质细胞、黏蛋白和糖蛋白构成；胶原纤维有规律地与角膜表面平行排列，形成200～300层胶原纤维板[3]。胶原纤维的含量和分布与角膜生物力学特性有重要关系，作为角膜主要承载层和胶原层，基质层是角膜生物力学特性的主要贡献者，且与角膜硬度直接相关[3-4]。

2 角膜硬度的测量技术进展

迄今为止，已经建立了多种测量角膜生物力学性能的方法，如轴向拉伸测试、膨胀测试、原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)、弹性成像技术、光学相干弹性成像(optical coherence elastography，OCE)、超声剪切波成像(supersonic shear wave imaging，SSI)、眼反应分析仪(ocular response analyzer，ORA)和Corvis ST等。不同测量方法的检测原理、样本要求、操作复杂度及应用场景不尽相同，具有各不相同的应用潜力。

2.1 拉伸和膨胀测试角膜硬度离体测量最为经典的是轴向拉伸测试和膨胀测试，二者通过测量角膜的应力-应变反应，计算弹性模量，获得角膜的生物力学参数。轴向拉伸测试是单轴试验，可评估平行于应变方向的胶原纤维，但是忽略了角膜曲面变平和拉伸的影响[5-6]。膨胀测试是双轴和轴对称试验，克服了轴向拉伸测试的缺陷，但是它存在技术本身带来的操作难题，包括潜在的气体泄漏及在溶液中溶解气体时控制压力困难[6]。此外，尽管轴向拉伸测试和膨胀测试是经典的角膜硬度测量方法，但这两种方法均为破坏性的，且会改变角膜的生理状态，故无法准确测量角膜硬度和在活体状态下应用[7]。

2.2 AFMAFM通过检测样品与微悬臂针尖之间极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质，广泛应用于生命科学、材料科学领域[8]。AFM可在探针接近或压入样品表面后再离开的过程中，测量并记录探针所受的力，得到力-距离曲线，通过分析针尖-样品作用力，得到样品的各种物理属性，如压弹性、黏弹性、硬度等[9]。AFM具有样品制备要求低、对样品原状态影响小、测量环境无特殊要求及测量分辨率达纳米级等优点[8]。然而AFM检测样本需要经过制备处理，检测探针需与角膜直接接触，因而难以应用于临床患者的角膜硬度测量。

2.3 弹性成像技术弹性成像技术是通过内置力学模型，利用成像组织的位移来量化其生物力学特性的一类测量技术。传统的弹性成像技术，如超声弹性成像、磁共振弹性成像等，均依赖于额外给予的力学刺激，然后通过测量组织对刺激的位移反应来量化组织的生物力学特性[10-13]。弹性成像技术主要缺点包括需要较大的刺激才可产生可测量信号、较差的空间分辨率和基于接触式测量[7]。

2.4 SSISSI是基于超声技术的组织硬度测量方案，也可用于角膜硬度的测量。Nguyen等[14]使用SSI检测了离体及在体的猪角膜样本，生成了描述角膜硬度的二维和三维图。然而，SSI需要与角膜直接接触以实现声耦合，这一操作本身会导致患者不适，且其空间分辨率也相对较低，因而限制了其在临床的应用。

2.5 OCE基于光学相干断层扫描(OCT)的弹性成像技术OCE是通过OCT检测组织位移和应变图，生成组织弹性和黏弹性特性的图像，并最终生成弹性模量的定量图，具有微米级空间分辨率、纳米级灵敏度等优点[7-15]。OCE的测量过程分为机械载荷、组织响应和运动检测三步，其中机械载荷有静态和动态、接触和非接触之分，动态非接触的方法更适用于临床[15]。

2.6 布里渊显微镜布里渊显微镜是一种非侵入性的检测手段，是通过光学方法来量化组织硬度的方法。简单来说，当用单色光照射物体时，光子会经历轻微的频率偏移，这可能与物体的材料特性及密度有关[16]。这种基于布里渊频移分析的非侵入性光学技术能够以微米级的空间分辨率生成角膜的深度弹性分布图，已用于人角膜生物力学测量的体内外研究[17-18]。尽管布里渊位移可能与弹性有关，但要准确地从布里渊位移中获得定量的生物学参数(如弹性模量)仍然是一个挑战[19]。

2.7 临床常用检测方法及进展以上检测方法仅适用于实验，临床中尚不可用。目前投入商用的角膜生物力学测量仪器有ORA和Corvis ST。ORA是一个非接触式眼压计，其原理是利用可控的空气脉冲压陷3～6 mm范围的中央角膜，使其发生变平-凹陷-变平-复原的形变过程，光电系统监测记录角膜2次变平时空气脉冲的压力，最后通过系统计算得到角膜滞后量和角膜阻力因子[20-23]。其中，角膜阻力因子是反映角膜硬度的参数。Corvis ST与ORA原理类似，二者区别在于数据采集和分析系统。Corvis ST采用高速Scheimpflug摄像机(每秒4330帧)记录下角膜的运动，然后在内置的控制面板上以超慢速度回放并记录图形，最后根据记录的图形计算出相关生物力学参数，如中央角膜厚度(central corneal thickness，CCT)、眼压、形变幅值比率、第1次压平时的刚度参数(stiffness parameter at first applanation,SP-A1)等[24]。其中，SP-A1是角膜硬度参数[24-25]。虽然这些参数可以为疾病检测提供有用的信息，但由于其不能测量弹性模量，且测量受角膜厚度和眼压的影响较大，因此其检测角膜生物力学特性的能力尚存在争议[26-27]。

除上述专为角膜生物力学测量开发的各种检测手段和仪器之外，近期，Pye[27]还介绍了2种使用临床现有仪器估算活体角膜弹性模量的方法。一种方法适用于所有人群，其利用Goldmann压平眼压计和帕斯卡动态角膜眼压计(pascal dynamic corneal tonometer，PDCT)测量中央角膜曲率(central corneal curvature，CCC)、CCT和眼压，计算表征角膜硬度的Ecalc值。PDCT可在任何情况下得到更准确真实的眼压，使角膜硬度的测量结果更接近真实。另一种方法仅适用于年轻健康人，利用Goldmann压平眼压计测得CCT和Goldmann眼压(tonometer intraocular pressure of Goldmann，IOPG)，计算Eiopg值。Pye[27]认为由于年轻健康成人的Ecalc和Eiopg之间有很强的相关性，而且CCC对Eiopg没有影响，因此，仅从CCT和IOPG计算正常角膜Eiopg表征角膜硬度是可行的。CCT和IOPG是在临床中常规测量的指标，这将使Eiopg在临床中相对容易获得。

目前的角膜硬度测量方法取得诸多进展，也面临相当多的技术及应用挑战。在未来的一段时间内，相关的研究工作仍集中在两方面：(1)使用已相对成熟的技术对角膜硬度这一生物力学特性进行分析，深化其参与角膜功能的调节及相关疾病的发展中作用的认知，提高包括临床医师在内的研究人员对该领域的认识；(2)探索新的用于检测角膜硬度的技术手段，这将有助于开发更精确便捷的检测手段，有助于相关研究的开展。

3 影响角膜硬度的因素

角膜生物力学由细胞外基质、胶原层、渗透压、激素和环境条件共同决定[28]，凡是影响上述条件的因素都可能对角膜硬度产生影响。角膜自身状态、角膜水合状态和胶原交联状态的改变与角膜硬度的改变密切相关。角膜基质的含水量为80%，其水合状态是影响角膜硬度的因素之一[29]。Hatami-Marbini等[30]研究了猪角膜硬度与水化/脱水引起的角膜厚度变化的关系，发现猪角膜面内弹性模量随角膜厚度的减小(脱水)而增大。此外，与脱水的角膜相比，肿胀的角膜具有更柔软的拉伸特性、更低的硬度[31]。有研究关注胶原交联状态与角膜硬度相关性，发现随着年龄的增长，糖基化诱导的角膜基质胶原纤维间交联增加，胶原蛋白不断沉积导致胶原纤维横截面积增加，这两种年龄相关的角膜变化均可能使得角膜随着年龄的增长而变得越来越硬[32-33]。

3.1 眼部疾病及手术眼部疾病，尤其是涉及角膜的疾病会对角膜硬度产生影响，如角膜营养不良性疾病、KC、迟发性芥子气性角膜病等。相关研究表明，角膜硬度与眼压、屈光不正和前房容积也有一定的相关性，但角膜硬度与上述因素的因果关系尚无明确定论[34-36]。此外，角膜手术也会改变角膜的硬度，如角膜交联术可增强角膜硬度、角膜屈光手术和白内障手术可降低角膜硬度[37-39]。角膜基质是角膜硬度的主要贡献组织，侵及基质层的感染性角膜炎、角膜外伤及基质层的清创操作均会对角膜硬度产生一定程度的影响，然而，不同因素导致的角膜损伤及疾病的不同病程对角膜硬度的影响尚需进一步研究。

3.2 激素和全身性疾病除眼部的影响因素外，激素和全身性疾病也可对角膜硬度产生影响。Spoerl等[40]研究发现，雌激素可使猪角膜硬度降低，并提出这或可解释女性屈光手术后角膜扩张的发生率高于男性的临床现象。自身免疫性疾病，如Sjögren 综合征、风湿性关节炎等均表现出角膜硬度降低[41-42]。糖尿病是一种以高血糖为特点的常见的代谢性疾病，高血糖增加糖基化终末产物(advanced glycation end-product，AGE)介导的胶原纤维非酶交联，进而增加角膜硬度[43-44]。此外，糖尿病患者的血糖控制水平也可对角膜硬度产生影响，血糖控制不佳的糖尿病患者角膜硬度更高[45]。

3.3 药物影响某些药物的使用也可影响角膜硬度。研究发现，糖皮质激素可降低角膜硬度，Spoerl等[46]发现使用含氢化可的松的培养基孵育新鲜猪角膜可使角膜弹性模量减小，角膜硬度降低37%；与之类似的是 Yu等[47]发现用氟米龙给兔滴眼8周，实验组角膜硬度较对照组降低33.5%。前列腺素也可降低角膜硬度，将兔角膜分别在曲伏前列素溶液和无曲伏前列素的相似溶液中保存10 d，结果显示，曲伏前列素溶液组的角膜硬度明显降低[48]。

4 角膜硬度与眼部疾病的相关性

随着角膜硬度检测技术的进步和对眼部疾病认识的深入，角膜生物力学在眼科疾病诊疗中的作用也逐渐被发掘。角膜硬度已被应用于KC的诊断、眼压的精准测量以及屈光术后残余屈光不正的预测等。

4.1 角膜硬度与圆锥角膜KC是一种以角膜变薄和扩张为特征的双侧进行性角膜病变，可导致严重的视力障碍，其特征是中央或中央旁基质变薄、角膜曲率改变、角膜细胞密度降低、胶原纤维板层数量减少及基质中的成纤维细胞降解[41]。角膜基质是角膜生物力学特性的主要贡献结构，KC患者表现为角膜硬度降低，对于尚无临床症状的KC患者，角膜生物力学的检测也是发现并诊断KC的重要手段[49-50]。另外，Shah等[50]发现，随着KC病情进展，角膜硬度随之降低。交联或手术治疗后的KC患者角膜硬度的随访对评估治疗效果和预测疾病复发也有极为重要的意义[51]。

4.2 角膜硬度与屈光手术角膜屈光手术破坏了角膜的原有结构，会对角膜生物力学特性产生一定程度的影响，表现为角膜硬度降低。Ortiz等[52]比较了KC患者和LASIK术后患者的角膜硬度，尽管LASIK术后角膜硬度有所降低，但依然高于KC患者角膜硬度。与之不一致的是，Shah等[50]发现，LASIK和LASEK术后角膜硬度明显降低，但与KC患者相比差异无统计学意义。角膜屈光手术改变角膜硬度的潜在影响因素很多，如手术方式、消融深度及患者的屈光不正类型等，因此两项研究结果存在差异并不奇怪，但是屈光术后角膜硬度降低的趋势是一致的。

角膜扩张是角膜屈光术后的严重并发症，考虑到角膜扩张是角膜组织结构的直接变化，其产生必然与角膜生物力学存在相关性。通过将角膜硬度检查纳入到角膜屈光术前及术后常规分析，对照角膜扩张的患者及其他患者，可帮助人们探索角膜硬度及其他生物力学参数与角膜扩张发生的相关性，同时探索其能否作为预测发生角膜扩张或KC的风险因子，有助于完善屈光手术的诊疗流程。

4.3 角膜硬度与青光眼青光眼是最常见的致盲性眼病之一，眼压是其诊断、预后及治疗效果监测的关键指标，因此，准确的眼压监测对青光眼患者管理十分重要。目前测量眼压的金标准是Goldmann压平眼压计测量法，但是其准确性受角膜整体硬度的影响[53]。Vinciguerra等[25]研究发现，与正常受试者、高眼压症患者、高眼压青光眼患者相比，正常眼压青光眼患者角膜硬度参数SP-A1明显降低。此外，他们还对原发性开角型青光眼患者视野丢失情况和角膜生物力学相关性进行了研究，发现角膜硬度较小的患者更容易出现视野丢失[25]。

青光眼患者的临床管理中应该考虑到角膜硬度对眼压测量的影响，对正常眼压青光眼患者有必要将低角膜硬度作为预测其进展的危险因素[25]。由于糖尿病患者的角膜硬度会因AGE介导的胶原纤维非酶交联增加而变硬，导致测量眼压过高，这可能增加青光眼的误诊率。因此，针对糖尿病患者的眼压测量也应考虑到这一点[54]。

4.4 角膜硬度与角膜上皮损伤愈合角膜上皮是角膜的最表层组织，感染、外伤及理化刺激等因素可使其损伤。角膜上皮损伤后，可以通过上皮细胞的增殖和迁移完全修复。角膜硬度可对上述细胞行为产生重要影响，Masterton等[55]发现较硬的底物倾向于促进细胞分化，诱导成熟的角膜上皮细胞产生；而较软的底物则更有助于维持细胞的干性，诱导角膜缘干细胞表型表达。Gouveia等[56]关于角膜硬度影响上皮细胞行为的在体研究显示，利用胶原酶软化碱烧伤兔角膜，可促进角膜缘上皮干细胞样表型表达，从而改善碱烧伤愈合。此外，角膜硬度还可影响间充质干细胞对角膜上皮损伤愈合的促进作用[57]。鉴于此，在临床工作中角膜上皮愈合不良的患者是否存在角膜硬度异常需要进一步探索和研究。

虽然本综述只提及了角膜硬度与KC、角膜屈光手术、青光眼、角膜上皮损伤愈合等常见眼科疾病中的相关性，但其临床价值远不止于此,需持续不断地进行相关研究。

5 总结

综上所述，角膜硬度是最常见的生物力学指标之一，其大小受多种因素影响。角膜硬度既会影响眼部疾病的发生，又会随着疾病的进展而变化。在诊治和随访相关疾病过程中，临床医师应充分考虑到角膜硬度的影响，并监测角膜硬度变化情况。此外，角膜硬度的测量方式和参考指标并无统一，未来的研究中期待有更精确、标准的测量手段和计算模型服务于临床和科研。