BMP4/Smad信号通路的分子机制及其在眼部疾病中的作用△

胡慧聪 张家豪 张妍 何宇茜

骨形成蛋白(BMP)是转化生长因子-β(TGF-β)中的一员，与细胞的发育、增殖、凋亡、形态发生、纤维化等密切相关。BMP4主要通过Smad信号通路调控下游基因的表达。研究表明，BMP4/Smad信号通路在角膜、晶状体、视网膜的发育中起重要作用[1]。同时，BMP4及相关受体在成熟的眼组织中高度表达[2]，说明BMP4/Smad信号通路与一些眼部疾病的发病机制密切相关。本文主要综述了BMP4/Smad信号通路的分子机制、BMP4/Smad信号通路在眼发育中的作用，以及其对一些眼部疾病的影响。

1 BMP4概述

BMP最初被认为是一种骨诱导生长因子，可以促进骨和软骨的形成，同时与许多疾病的发病机制有关。BMP信号通路不仅与骨的发育、疾病和修复有关[3]，还与血管系统疾病密切相关[4]。多项研究表明，BMP信号通路在肿瘤的发生中起重要作用[5]。此外，BMP信号通路在多个系统的发育中起关键作用[6-7]。

BMP4是BMP中的一员。BMP4为非活性前体蛋白，有408个氨基酸。BMP4在胚胎发育中起重要作用，其与神经发生、晶状体诱导、软骨和骨骼发育、泌尿生殖系统发育、肢体发育、毛囊再生和牙齿形成有重要关联[1]。BMP4也与肿瘤的形成、内皮损伤修复有关[8]。BMP4还在与肥胖和糖尿病相关的脂肪原细胞的定型和分化方面发挥关键作用[9]。BMP4在眼发育中影响重大[9-11]。此外，BMP4及其受体在成熟眼组织的多个部位表达[2]，这提示成人眼的不同部位需要不同的BMP4信号来维持其组织形状、分化水平和功能。

2 Smad信号通路的概述

脊椎动物有8种Smad蛋白，其根据功能分为三大类：第一类为受体调节型Smad(R-Smads)，包含Smad2/3和Smad1/5/8；第二类为共同通路型Smad(Co-Smad)，仅包括Smad4，它是TGF-β家族各类信号转导过程共同需要的介质；第三类为具有抑制性的Smad(I-Smads),包括Smad6和Smad7，主要作用为抑制或调节TGF-β家族的信号转导[12]。

BMP配体信号涉及到两种跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，称为BMP-Ⅰ型受体(BMPR-Ⅰ)和BMP-Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)。BMP通常与BMPR-Ⅱ结合，而后使BMPR-Ⅰ磷酸化。磷酸化的BMPR-Ⅰ启动下游信号转导——经典Smad或非经典Smad的信号通路被激活。

2.1 经典Smad信号通路在经典Smad信号通路中，被激活的BMPR-Ⅰ使R-Smads磷酸化，而后与Co-Smad4结合形成复合体。该复合体可以调节目的基因的转录，调节细胞的自我更新和分化，细胞的增殖、迁移和凋亡[13]。例如，BMP/Smad信号通路与多种干细胞的增殖分化有关[14]，BMP/Smad信号通路还与多种细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有关[15]；在肝脏的炎症反应中，BMP/Smad信号通路发挥重要作用[16]。其中BMP4/Smad通路与眼的发育密切相关，且与多种眼部疾病的发病机制相关联。

2.2 非经典Smad信号通路非经典Smad信号通路也是BMP的一个重要通路，包括ERK、JNK、p38 MAPK等。非经典Smad信号通路与许多生理和病理过程相关，如细胞的增殖和分化、介导炎症反应、细胞凋亡、细胞迁移以及应激反应[17-19]。在眼中，ERK信号通路与晶状体发育有关[20]；JNK信号通路与视网膜退行性疾病病变密切相关[21]；p38 MAPK信号通路可能抑制角膜内皮细胞的增殖[22]，还与糖尿病视网膜病变有关[23]；JNK、p38 MAPK信号通路发生改变可能影响视网膜色素上皮(RPE)氧化应激损伤的程度[24]。

3 BMP4/Smad信号通路的分子机制

在经典Smad信号通路中，BMP4与BMPR-Ⅱ结合，使BMPR-Ⅰ磷酸化。活化的BMPR-Ⅰ使Smad1/5/8磷酸化。磷酸化的Smad1/5/8与Co-Smad4结合形成复合体，该复合体作为细胞核的转录因子参与靶基因表达的调控。BMP4/Smad信号通路与多种细胞调控有关。BMP4/Smad信号通路可以影响血管内皮屏障功能，调节血管内皮细胞连接的稳定性[25]。BMP4可以通过Smad1促进细胞外基质(ECM)的沉积[26]。此外，BMP4还可以促进与ECM密切相关的结构的生长，并调控其发育的完整性[27]。

经典BMP4/Smad信号通路在眼部起重要作用。Kiyono等[28]研究显示，在新生大鼠眼部发育过程中，BMP4/Smad1介导瞳孔区的毛细血管内皮细胞凋亡，从而使瞳孔膜退化，促进瞳孔和晶状体完整的发育结构形成。Liu等[29]研究显示，Co-Smad4参与作用角膜上皮和角膜基质细胞的生长发育和稳态[29]。Xu等[30]研究显示，在RPE中过量表达BMP4后行激光诱导实验，发现脉络膜新生血管几乎无法产生，提示BMP4对新生血管具有主导调控作用，而且BMP4依赖Smad1/5信号通路降低肿瘤坏死因子(TNF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达，抑制脉络膜新生血管。

在非经典Smad信号通路中，活化的BMPR-Ⅰ激活下游信号，上调或下调相关因子的表达量，进而参与调控细胞的凋亡、迁移等[17-19]。其中BMP4/ERK1/2信号通路与多种细胞的EMT有关[31]；BMP4可以通过JNK和p38 MAPK信号通路对内皮细胞的分化和凋亡起重要作用[32-33]；BMP4还可以通过JNK信号通路参与细胞的自噬[34]。

BMP4/Smad信号通路与Wnt/β-catenin、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等信号通路具有相互调节作用。例如，在Wnt/β-catenin信号通路调节的肠道发育中，BMP4/ERK1/2信号通路起重要作用[35]；在眼中，Wnt/β-catenin信号通路可以通过调控BMP4/Smad信号通路，影响角膜上皮的分化和稳态[36-37]；BMP4/Smad信号通路还可以与FGF信号通路相互调节，进而影响晶状体的发育[10]。

4 BMP4/Smad信号通路在眼发育中的作用

4.1 BMP4/Smad信号通路在眼前节发育中的作用眼前节发育不全(anterior segment dysgenesis,ASD)是眼前节组织的一系列发育综合征，目前已发现其与BMP4密切相关[11]。但是尚不清楚是何种来源的BMP4导致ASD。Rausch等[38]研究显示，BMP4在睫状缘表达丰富，但睫状缘衍生的BMP4在眼部的发育中并不起主要作用，因此，他们认为ASD是一种非自主细胞来源的缺陷。

此外，BMP4还与角膜上皮分层密切相关，这提示BMP4可能与角膜形成有关[39]。目前已证实，Wnt/β-catenin通路在角膜上皮细胞的发育中发挥重要作用，在小鼠发育过程中使用该通路的拮抗剂Dkk2会抑制角膜的分化[40]。当β-catenin缺失时，会导致BMP4表达上调，ERK1/2通路被激活，同时Smad1/5被磷酸化，p63在小鼠的角膜基底上皮细胞中表达增加[36]。其中p63可以启动角膜上皮细胞分层并维持角膜基底层角质细胞的增殖[41]。综上所述，Wnt/β-catenin通路可以通过调控BMP4/Smad通路，进而影响角膜上皮分层。

4.2 BMP4/Smad信号通路在晶状体发育中的作用BMP4/Smad信号通路与晶状体的发育密切相关，BMP4与Pax6(一种眼发育的必要基因)在晶状体板的形成中起协同作用。敲除BMPR-IA会降低BMP4的表达，虽不导致影响晶状体的形成，但会严重影响晶状体的发育[42]。FGF信号通路与BMP信号通路协同调节晶状体的发育。BMP信号可以使晶状体细胞维持在最佳的FGF信号响应状态，同时FGF信号可以上调BMP信号介导的下游基因的表达[43]。Gata3基因是晶状体发育的关键基因之一，Gata3基因缺失会引起晶状体发育的多种缺陷，包括细胞周期异常，纤维细胞分化受到抑制[44]。有趣的是，BMP和FGF信号通路可以通过识别Gata3基因的启动子和增强子，使分化中的晶状体纤维细胞中的Gata3表达上调，同时在体外实验中还发现FGF2和BMP4可以调节Gata3基因的启动子和增强子[10]。这说明，探究BMP4/Smad通路与FGF通路的协同调节作用，对研究晶状体发育有重要意义。

4.3 BMP4/Smad信号通路在视网膜发育中的作用视网膜是眼中发育最早的组织，BMP4/Smad通路在视网膜的发育中发挥重要作用。当BMP4缺失时，会造成多种与视网膜发育相关基因的异常表达[45]。当敲除BMPR-ⅠA和BMPR-ⅠB时，胚胎的视网膜生长和视网膜神经发育受到严重影响，出现严重眼部缺陷。如果视泡中的BMP4表达降低，视杯将难以形成，并且视网膜远端囊泡中特定基因的表达显著降低[46]。分化抑制因子(inhibitors of differentiation，Id)可以调控细胞周期和分化。BMP4、BMPR-IB、Smad1/5/8在小鼠胚胎期(E13.5～E18.5)和出生后早期(P)1期的视网膜中高表达，并且视网膜前体细胞中存在BMP/Smad/Id信号通路，因此BMP4/Smad1/5/8/Id信号通路可能会影响视网膜的发育以及视网膜细胞的增殖分化[47]。进一步探究BMP4/Smad通路在视网膜发育中的作用，将为许多视网膜疾病的治疗带来新方向。近期Chichagova等[48]研究显示，通过激活IGF1和BMP4信号通路使人类诱导多功能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)转化为视网膜类器官，希望将BMP4/Smad通路在视网膜发育中的重要作用转向临床应用。

5 BMP4/Smad信号通路在眼部疾病的作用

5.1 BMP4/Smad信号通路在与角膜有关的疾病中的作用BMP4及其相关受体在成熟的角膜组织中表达丰富[2]，同时可以调控角膜细胞的增殖和凋亡。角膜上皮由角膜缘干细胞(limbal stem cell，LSC)产生，LSC缺乏症(LSC deficiency,LSCD)是由于LSC缺失或功能障碍所导致的疾病，通常会引起持续性疼痛和严重的视力障碍。对于单侧LSCD，通常采用自体移植的治疗方法，但这并不适用于双侧的LSCD。Kamarudin等[49]研究显示，将hiPSC分化为角膜上皮祖细胞，这为双侧LSCD治疗提供了一个方向[49]。同时他们还发现内源性BMP信号的水平会影响hiPSC分化为角膜上皮样细胞的能力，其中BMP4可以诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)分化为角膜上皮祖细胞以及成熟的角膜上皮样细胞[49]。Qin等[50]研究显示，使用视黄酸(retinoic acid，RA)、BMP4、条件培养基以及人去细胞的基质微透镜，可以诱导hiPSC获得高纯度的角膜上皮细胞系。综上所述，探究BMP4/Smad通路在诱导hiPSC分化为角膜上皮样细胞中的作用，对LSCD的治疗有重要意义。

BMP4/Smad通路还与角膜上皮的更新密切相关。角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem cell，LESC)缓慢增殖分化，并向角膜中央区域迁移，以维持角膜上皮的更新[51]。当角膜发生纤维化时会造成LESC的丢失，LESC的状态主要取决于其所处部位的生物力学特性。Gouveia等[37]研究显示，在体外实验中，当基质硬度增加时，BMP4表达上调，而β-catenin、ΔNp63表达降低，他们认为Wnt/β-catenin信号通路以及其下游的BMP4/Smad通路与这一过程密切相关。因此，当BMP4/Smad通路密切活动时，角膜基质硬度增加，进而造成LESC的丢失，由此影响角膜上皮的更新。

5.2 BMP4/Smad信号通路与青光眼的关系前文已介绍BMP4与ASD关系密切，而ASD常伴随有青光眼的发生。有研究者在3D成像实验中发现，BMP4(+/-)杂合子小鼠相对于野生型小鼠的Schlemm管部分缺失，这可能是该种小鼠眼压(IOP)升高的原因之一[52]。BMP4杂合子缺失小鼠的ASD症状包括小梁网(trabecular meshwork，TM)发育不全、角膜与虹膜粘连，而TM是房水流出的主要部位，TM发育不全是青光眼重要的发生原因之一[53]。因此BMP4的缺失与房水流出受阻密切相关，由此造成IOP升高，诱发青光眼。

原发性开角型青光眼(POAG)是青光眼的主要类型之一。IOP升高是POAG的主要风险因素之一，这主要是由于TM的房水流出受阻以及TM的ECM沉积。TGF-β2会增加ECM的沉积。而BMP4/Smad信号通路可以诱导Id1/3表达，抑制TGF-β2通路，进而抑制ECM的产生[54]，从而降低IOP。这说明BMP4/Smad信号通路或许会成为POAG新的治疗靶点之一。

5.3 BMP4/Smad信号通路在与视网膜有关的疾病中的作用

5.3.1 BMP4/Smad信号通路在视网膜神经保护和修复方面的作用BMP信号通路已被证实在神经系统的发育中具有重要作用，但其在发育成熟的神经系统的作用机制尚不清楚。BMP/Smad1/5/8信号通路对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)具有神经保护作用。Ueki等[55]研究显示，通过在玻璃体内注射N-甲基-D-天冬氨酸诱导RGC大量死亡，结果发现BMP2、BMP4和BMP7表达上调，Smad1/5/8磷酸化，同时Id1在视网膜的表达上调。其中BMP4/Smad1与中枢神经系统的轴突再生有关，可以促进脊髓后索轴突的再生和损伤修复[56]。BMP4/Smad1通路在RGC的神经突以及RGC再生时表达高度上调，这意味着BMP4/Smad1通路是RGC轴突再生和损伤修复的一个潜在治疗靶点[57]。BMP4/Smad1/5/8还可以通过抑制TGF-β/Smad2/3而促进Müller胶质细胞来源祖细胞(Müller glia-derived progenitor cell，MGPC)的形成，进而影响视网膜神经元的再生[58]。综上所述，BMP4/Smad通路可以通过作用于TGF-β通路以及下游基因对视网膜神经的保护和再生发挥一定作用。

5.3.2 BMP4/Smad信号通路与年龄相关性黄斑变性的关系随着年龄相关性黄斑变性(AMD)的发展，AMD后期可以分为萎缩性AMD和新生血管性AMD。BMP4在这两种AMD中的表达存在差异，这意味着BMP4可能是决定AMD后期发展的一个分子开关[59]。

BMP4在萎缩性AMD患者的RPE以及相邻的ECM中高度表达[60]。RPE氧化应激和衰老是AMD发生的重要因素之一。BMP4可以通过经典Smad通路和p38 MAPK通路，激活p53和p21 (Cip1/WAF1)，并且减少Rb磷酸化，从而触发RPE的衰老，这意味着BMP4可能是氧化应激诱导的萎缩性AMD的一个新的治疗靶点[61]。

BMP4还可以通过直接抑制MMP9，间接抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而在新生血管性AMD中起到抗血管生成的作用。其中BMP4可以通过Smad1/5抑制RPE细胞中TNF诱导的MMP9的表达[62]。Tosi等[63]研究显示，BMP4/Smad通路或许还可以通过抑制TGF-β1，对新生血管性AMD起到一定的治疗作用。

5.3.3 BMP4/Smad信号通路与增生型玻璃体视网膜病变的关系增生型玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是一种严重的影响视力的视网膜脱落并发症，其特征是形成可收缩性的纤维膜，并且与RPE细胞的EMT密切相关。BMP4在抑制纤维化方面发挥着重要作用，BMP4可以使Smad1/5/8磷酸化，抑制由TGF-β诱导的Smad2/3磷酸化，从而抑制RPE细胞中由TGF-β引起的EMT[64]。这说明BMP4/Smad通路可以抑制TGF-β通路，进而抑制RPE细胞的EMT，对PVR起一定的积极作用。

6 小结

BMP4在眼发育和成熟眼组织中起重要作用。如果BMP4/Smad信号通路被阻断，将会严重影响角膜、晶状体、视网膜的发育。从这一角度来看，或许会为诱导hiPSC从而治疗眼部疾病提供一个新思路。

此外，BMP4在成熟眼组织的多个部位表达。通过研究BMP4/Smad通路，可以进一步探究一些眼部疾病的发病机制，为临床治疗提供了新的可能。例如，BMP4/Smad通路与角膜上皮稳态密切相关，这或许会为角膜修复提供新方向；BMP4及其受体在TM中大量表达，与房水循环密切相关，可能成为青光眼新的治疗靶点；BMP4/Smad通路在视网膜神经和血管中的作用也极有研究意义，将为许多视网膜疾病的治疗提供新思路。

同时BMP4/Smad通路与Wnt/β-catenin、FGF、TGF-β等通路相互作用，这几条通路本身与眼发育及部分眼部疾病关系密切，进一步探究眼组织中BMP4/Smad通路与其他通路的协同作用，或许会为眼发育及眼部疾病的研究带来意想不到的收获。