新型鸭呼肠孤病毒病研究进展

谢碧林 林志敏 林彬彬 翁汉东 王秀祯 莆田市农业科学研究所 福建莆田 351144

新型鸭呼肠孤病毒病是由一种有别于番鸭呼肠孤病毒的新型鸭源病毒引起的， 可引起番鸭、 半番鸭、麻鸭和北京鸭等水禽发病[1-5]，临床上表现为肝脏不规则块状或斑状坏死、出血性混杂、法氏囊出血以及脾脏不同程度坏死为特征的新疫病，命名为“新肝病”或“鸭出血性坏死性肝炎”。 研究表明，该病是由一种RNA 病毒引起的，该病毒分类为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型呼肠孤病毒[1]。 由于呼肠孤病毒的基因组属于多节段RNA， 容易发生基因突变，出现新的致病毒株可能性大大增加，给水禽养殖业带来新的危害。 本文对新型呼肠孤病毒病研究现状进行梳理，综述如下。

1 病原学

1.1 病原特性 新型鸭呼肠孤病毒直径70 nm 左右，在电镜下呈球形，二十面体对称，无囊膜，双层衣壳结构。分离毒不能凝集鸽、鸡、鸭、鹅、兔、鼠和人O型红细胞[1,6]。

该病原核酸在SDS-PAGE 电泳图谱中具有禽呼肠孤病毒（ARV）的特征：有10 个RNA 片段，按片段大小可分为三类即大片段、中片段和小片段，分别标识为L1-L3、M1-M3、S1-S4； 其电泳图谱与ARV相似，与MDRV 差异较大[1,6]。 L、M 和S 基因组片段分 别 表 达 λA、λB、λC、μA、μB、μNS、σC、σA、σB、σNS 等10 种蛋白，S1 基因含有三个开放阅读框，分别表达P10、P18 和σC。 NDRV 基因组表达的蛋白中，除了μNS、P10、P18 和σNS 四种非结构蛋白外，其余的都是结构蛋白， 这些蛋白在病毒繁殖周期的各个阶段具有重要的作用[7]。

1.2 理化特性 NDRV 对FUDR、氯仿等不敏感，对胰蛋白酶中度敏感， 对pH3、 紫外线、 甲醛和热敏感[1,6]。

1.3 致病性 1 日龄雏番鸭、 雏半番鸭人工感染NDRV 分离毒后， 均能复制出与自然病例相同的临床症状和病理变化。主要剖检特征为肝脏出血坏死，心脏出血，法氏囊和肾脏出血[1,6]。分离毒对雏番鸭和雏半番鸭的致死率分别为20%～53%和13%～33%。攻毒试验显示， 其发病率和病死率与攻毒剂量呈正相关， 且爪垫接种攻毒较口鼻和腿肌接种攻毒更敏感；相对于雏半番鸭，雏番鸭对病毒更敏感，而雏鸡和雏鹅对NDRV 不敏感[8-9]。

NDRV 分 离 株 能 在AD293、CEF、MDEF、Vero、MDCK、Marc145、ST、BHK-21 等单细胞中增殖并产生巨融合状细胞病变， 但NDRV 分离株在PK、DF1细胞中盲传3 代均未出现病变[9-10]。

2 流行病学

各品种鸭均可发生，且一年四季均可发病；发病日龄为5～25 日龄，大部分在5～10 日龄发病；病程5～7 d，发病率5%～15%、病死率2%～13%，感染日龄越小或并发其它疫病时，发病率和病死率会更高[1]。

林锋强等采用分离株攻击1 日龄雏鸭， 以研究新型鸭呼肠孤病毒在番鸭体内分布和排毒规律。 应用RT-PCR 检测番鸭攻毒后的相关样本，了解病原在番鸭体内分布规律。 结果显示在攻毒后12 h，病毒在血液、脾、胸腺、肝、法氏囊中分布；攻毒后1 d在心、肺、肾、盲肠扁桃体、脑组织中分布。 攻毒后1 d 即可在喉头和泄殖腔棉拭子中检测到病毒核酸，而在12 d 后已不能检出。 表明番鸭接种毒株后1 d 开始向外界排毒，12 d 后停止排毒，向外界排毒时间为PI 1 d～9 d，其中3～6 d 是排毒高峰期[11-12]。

对主要发病日龄(3～15 日龄)的番鸭进行NDRV核酸检测，检出率最高的是脾，可达100%，其次是肝、心和法氏囊。因此，肝、脾可作为病毒检测和分离的首选脏器[11]。

3 病原学诊断

3.1 RT-PCR 方法 该方法是先应用反转录酶以RNA 为模板合成cDNA， 再以cDNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下扩增合成获得目的片段。 具有简便、快速、灵敏等优点，在动物疾病临床诊断上得到了广泛的应用。

王劭等[13]根据NDRV-NP03 株S3 基因全序列，应用引物设计软件， 设计合成一对特异性引物，以NDRV 分离株的RNA 为模板， 建立了一种特异性强、 灵敏度高的NDRV 检测方法。 该方法可以从NDRV 分离毒中扩增出长度为586 bp 的特异性核酸片段，灵敏度达到2 pg 病毒RNA，可应用该检测方法开展NDRV 的临床诊断和流行病学调查。 孔丰等[14]参考NDRV S3 基因的保守序列设计一对引物，建立起NDRV 的RT-PCR 检测方法，该方法能特异地从NDRV 分离毒中扩增到长度为298 bp 的核酸片段，灵敏度可达83.4 pg 病毒RNA。

3.2 多重RT-PCR 方法 多重RT-PCR 方法是在常规的RT-PCR 基础上进行改进。 在同一RT-PCR体系中加入多对引物，同时检测2 种以上病原核酸，它兼具快捷、高灵敏度及特异性等优点。

孙晓军等[15]根据鸭甲肝病毒（DHAV）的3D 基因序列和新型鸭呼肠孤病毒的S3 片段，建立可区分DHAV 和NDRV 的多重RT-PCR 检测方法。 该方法对DHAV 和NDRV 的最低检出量均为100 copies，临床样品的检测结果显示， 该方法是一种快速鉴别诊断DHAV 和NDRV 感染的有效手段。

3.3 荧光定量RT-PCR 方法 荧光定量RT-PCR方法是在常规RT-PCR 反应体系中改良发展起来的。 该方法通过荧光信号累计实时监测RT-PCR 的整个进程，最后与已经制订好的标准曲线比对，从而对监测对象进行定量分析的方法。 它融合了常规RT-PCR 技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱探测技术的高敏感性和定量精确等优点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量精确等优点。

丁明洋等[16]根据GenBank 中呼肠孤病毒S1 基因全序列， 设计合成一对特异性引物， 建立SYBR Green II 荧光定量PCR 检测方法， 检测反应在101～108copies/uL 具有良好的线性关系， 反应的检出下限为10 copies/uL，具有较高的敏感性和特异性。 韩宏宇等[12]根据NDRV 的S1 基因序列，设计一对特异性引物，建立了基于SYBR Green I 的实时荧光定量RT-PCR 检测方法，敏感性试验显示，该方法最低可检出15 copies 的病毒cDNA， 其病毒最低检出量为0.5 TCID50，具有良好的特异性和重复性。

3.4 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术（LAMP）能在等温（60～65 ℃）条件下，短时间内（通常是1 h 内）进行核酸扩增。 与常规PCR 相比，不需要模板的热变性、 温度梯度循环、 电泳及紫外观察等过程，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。

蔡跃佳等[17]针对新型鸭呼肠孤病毒保守序列设计特异性引物， 将RT-LAMP 技术与荧光染料钙黄绿素结合， 建立NDRV 钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法，并对该方法的反应温度、时间及体系进行优化。该方法可特异性检测出NDRV，最低检测限约为200 fg，且读取结果方便、直观。 于可响等[18]基于NDRV S3 基因的6 个保守区域设计4 条LAMP 引物，建立一步反转录环介导等温扩增（RTLAMP） 方法， 该方法具有良好的特异性， 对病毒RNA 的最低检出量为0.1 pg，是常规RT-PCR 方法的100 倍，适于基层实验室快速检测。

4 血清学诊断

王锦祥等[19]为建立快速检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体的方法， 以纯化的重组σC 蛋白作为包被抗原，并对该方法的反应条件进行优化，建立了NDRV间接ELISA 抗体检测方法。该方法仅对NDRV 血清检测为阳性，具有良好的特异性；其批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%，具有良好的重复性。利用建立的σC 蛋白间接ELISA 方法对80 份疑似鸭血清样品进行检测，结果显示与NDRV 全病毒间接ELISA 的符合率为88.75%。 该ELISA 方法为NDRV 的流行病学调查提供了快速、 特异的血清学检测方法。之后，王锦祥等[20]对以上检测方法进行优化，增加NDRV NP03 株的重组σB 蛋白作为包被抗原， 重新建立检测该病抗体的间接ELISA 方法，与NDRV 全病毒间接ELISA 相比较， 符合率高达92.5%，进一步丰富了该病抗体的检测方法。

陈海鹏[21]利用pET-28a 原核表达系统成功地表达了新型呼肠孤病毒σC 蛋白并纯化， 用纯化后的σC 蛋白作为包被抗原， 建立了具有良好特异性、重复性和敏感性的N-MDRV 间接ELISA 检测方法。对临床送检的血清样品进行检测， 检出率达到98.5%。

Yun T 等[22]克隆NDRV 的外衣壳（σC）并作为包衣抗原建立一种高灵敏度、 特异性间接酶联免疫吸附试验 （ELISA） 方法检测抗体， 可用于大规模的NDRV 感染血清学调查和抗体滴度监测。

5 防治措施

5.1 灭活疫苗 灭活苗是指先对病原进行培养，然后用加热或化学剂(通常是福尔马林)将其灭活，但仍保留其免疫原性， 注射后能使动物产生针对该病原的特异抵抗力。

陈仕龙等[23-24]以NDRV JM85 株为种毒研制安全、有效的油佐剂灭活苗，并通过免疫血清学检测及攻毒保护试验评价疫苗效果。结果显示，麻鸭二免后28 d 能够产生较高的中和抗体， 并能较长时间维持，且其子代雏鸭体内具有一定的母源抗体，能够抵抗强毒的攻击。 该疫苗可用于防控鸭新型呼肠孤病毒病。为了提升该病灭活苗的免疫效果，陈仕龙等采用透析的办法对病毒尿囊液中抗原进行浓缩， 提高了抗原浓度。 分别采用病毒尿囊液和浓缩后病毒尿囊液为抗原研制浓缩疫苗， 开展两者免疫原性对比试验。 通过对比得知，浓缩疫苗安全性好、免疫效果好；浓缩疫苗免疫雏鸭后的免疫保护性达100%。 表明浓缩疫苗安全、高效，在雏鸭上具有良好的免疫保护效果，具有良好的市场前景。

5.2 重组载体疫苗 重组载体疫苗是将病原体中可编译有效免疫原的基因片段通过生物技术手段插入载体基因组中， 接种后随含有该重组载体的疫苗株在体内不断增殖， 实现该有效抗原在体内表达的目标。

Zhu Y 等[25]为研制新型鸭呼肠孤病毒病疫苗，将NDRV 的σC 基因克隆到塞姆利基森林病毒(SFV)复制子载体pSCA1 中，构建了一种基于该复制子的自杀性DNA 疫苗，并对其进行评价。 结果表明，雏鸭可诱导产生特异性抗体、中和抗体、IFN-γ和IL-4。 此外，所有雏鸭都受到NDRV 野毒攻击的保护。

5.3 重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达， 并以基因产物-蛋白质或多肽制成疫苗。

梅敏敏等[26]根据NDRV XX 株σB 基因编码序列构建原核表达载体， 成功表达出约55 kU 的融合蛋白。 经Ni2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白，经Western blotting 和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白。 NDRV σB 蛋白的成功表达，为其功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。

毕庄莉[27]用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统分别表达了NDRV （NDRV TH11 株）σC 蛋白，获得的蛋白具有良好的免疫原性。 应用杆状病毒表达的σC 蛋白制备疫苗，免疫1 周龄雏鸭，免疫2 周后使用NDRV 强毒进行攻击，发现免疫组得到良好的保护性，保护率可达70%。 该蛋白可为后期研制有效的新型鸭呼肠孤病毒病疫苗提供了基础。

Bi Z 等[28]构建了含有NDRV σC 基因的重组杆状病毒，纯化后的蛋白作为亚单位疫苗的抗原。根据体液免疫反应、细胞免疫反应和对NDRV 攻毒的免疫保护来评估σC 疫苗的疗效。 结果表明， 用重组σC 蛋白免疫的所有雏鸭均能产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。此外，还观察到免疫后的雏鸭对致死剂量NDRV TH11 菌株攻毒的100%保护。结果显示，重组σC 蛋白可以作为疫苗的候选蛋白。

6 致病机制

Xiao R 等[29]利用共免疫沉淀法、GST pull-down试验和共聚焦显微镜研究σC 与宿主的易位相关膜蛋白1（TRAM1）之间的相互作用，分别通过RNA 干扰敲除TRAM1 基因和过表达TRAM1 基因， 探讨σC 对病毒复制的影响。结果表明，TRAM1 沉默有利于抑制病毒复制， 证实TRAM1 在NDRV 感染中的重要作用。

Chen X 等[30]对3 日龄雏鸭接种NDRV NP03 株和注射无菌Hank's 溶液以比较雏鸭盲肠内的微生物菌群情况，结果显示，相对于对照组，接种NDRV NP03 株的试验组雏鸭肠道细菌的相对丰度发生变化， 尤其是瘤胃球菌科和毛螺旋菌科的细菌显著减少，而志贺氏杆菌明显增多。 所以，番鸭感染NDRV可导致肠道菌群改变， 包括益生菌净损失与致病菌代偿性扩张，这些结果为NDRV 的潜在致病机制提供了新的见解。

7 小结与展望

当前， 对新型呼肠孤病毒的研究报道主要集中在NDRV 的小片段基因上， 关于σC、σB 蛋白的研究相对比较深入，而NDRV 致病机制方面的研究报道相对较少。

目前认为呼肠孤病毒σC 蛋白在病毒致病机制上具有多重功能，且该蛋白是NDRV 唯一能与宿主细胞吸附的蛋白， 为病毒入侵细胞提供前提条件[31-34]。σC 蛋白携带有特异性中和反应的表面抗原，能够产生中和抗体， 该蛋白将是研制亚单位疫苗的候选蛋白。 由于呼肠孤病毒科的核酸属于多节段基因， 以及RNA 聚合酶缺乏矫正功能， 导致病毒容易发生基因重组或抗原变异， 产生新的致病性菌株[35-36]，呼肠孤病毒的这个特性为研制有效的疫苗提出了挑战。 Du X 等[37]研制了一种具有广谱抗病毒活性的金丝桃素（HY）与具有高载药量和低细胞毒性的氧化石墨烯（GO）复合物，并研究该复合物（GO/HY） 在DF-1 细胞和NDRV TH11 株感染雏鸭体内的抗病毒活性。 结果提示GO/HY 对NDRV 具有体内外抗病毒活性， 为开发新型呼肠孤病毒病新疗法提供新的探索。由于抗生素对病毒无治疗作用，应用疫苗预防该病毒的侵袭是最为经济有效的做法，研制安全、高效的疫苗仍然是当前的研究重点。完善的NDRV 致病机制研究将在分子生物学水平上预防治疗新型呼肠孤病毒病成为可能。