肿瘤标志物ESM-1MMP-2和MMP-9鉴别良恶性胸腔积液的临床意义

刘清峰， 吴伟东， 古佳升， 桃卓嫣

胸腔积液是由于胸膜腔内液体的产生和吸收失衡，致使过多的液体在胸膜腔内聚积形成。临床上多种疾病可导致胸腔积液的生成，其病因不同，治疗方法也不同。尤其是恶性胸腔积液，如果不能及时诊断，可能会延误治疗时机。因此胸腔积液的鉴别诊断对后续的治疗尤为重要，而这也是临床上的一个难点。细胞学检查是目前国内外常用的鉴别方法之一，虽可作为确诊依据，但阳性率较低。近年来，染色体检测、单抗免疫细胞化学染色和端粒酶活性检测的应用使细胞学检查的灵敏度有所增加，但仍不理想[1-4]。内皮细胞特异因子-1(endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)是近些年来发现的一种新型内皮细胞分子，其在肺癌、肾癌、肝癌、胃癌和前列腺癌等肿瘤中呈现高表达，并且对肿瘤的发生发展、血管生成以及转移侵袭等进展过程中起着关键作用[5-9]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。近年来的研究[10-12]表明，肿瘤细胞分泌的MMP-2、MMP-9在肿瘤血管生成、肿瘤细胞浸润和转移灶形成过程中均起重要作用。本研究旨在通过检测良恶性胸腔积液中ESM-1、MMP-2和MMP-9的表达水平，探讨其在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的应用价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2018年1月至2019年3月暨南大学附属广州红十字会医院心胸外科收治的胸腔积液患者99例。其中恶性胸腔积液患者53例(恶性胸腔积液组)，男31例，女22例，年龄(47.1±12.5)岁；肺腺癌36例，肺鳞癌17例；经胸水细胞学病理检查或胸腔镜下病理检查确诊。良性胸腔积液患者46例(良性胸腔积液组)，男30例，女16例，年龄(45.6±13.2)岁；结核性胸膜炎患者30例，肺炎旁积液患者12例，心力衰竭患者4例；经胸水常规、生化检查、细胞学检查、临床表现或胸腔镜下病理检查确诊。排除合并肝、肾及其他感染相关疾病者。本研究已通过医院伦理委员会批准，研究对象知情同意参与。

1.2样本采集 研究对象在留取胸腔积液标本前均未接受过放化疗、抗结核、抗炎、使用免疫抑制剂等治疗。于入院后在超声引导下常规胸腔穿刺术取胸腔积液50 ml，立即将样品在-4 ℃条件下以1 500 r/min转速离心10 min，取上清液，-80 ℃待检。

1.3ESM-1、MMP-2和MMP-9的检测 采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定胸腔积液中ESM-1、MMP-2和MMP-9的水平。应用PHOMO酶标仪(赛默飞世尔FC)读取吸光度值(optical density value，OD值)，依据标准曲线拟合程度计算待测样品浓度。ESM-1、MMP-2和MMP-9试剂盒均购自北京晶美有限公司，所有的操作严格按照说明书进行。

2 结果

2.1两组胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平比较 恶性胸腔积液组胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平均高于良性胸腔积液组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平比较

2.2不同分层特征下恶性胸腔积液患者胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平比较 腺癌患者的胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平显著高于鳞癌患者(P<0.05)。T分期为T3-4期患者的胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平显著高于T1-2期患者(P<0.05)。有远隔器官转移患者的胸腔积液MMP-2和MMP-9水平显著高于无远隔器官转移患者(P<0.05)，但两者ESM-1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。性别、年龄、吸烟特征与恶性胸腔积液患者的胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平无显著关联(P>0.05)。见表2。

表2 不同分层特征下恶性胸腔积液患者胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9水平比较

2.3ESM-1、MMP-2和MMP-9鉴别诊断良恶性胸腔积液的效用分析结果 ROC曲线分析结果显示，ESM-1、MMP-2和MMP-9均具有鉴别良恶性胸腔积液的诊断价值(P<0.05)，其截断值分别为40.110 ng/ml、446.690 ng/ml和145.560 ng/ml。见表3，图1。将ESM-1、MMP-2和MMP-9进行联合诊断，结果显示，MMP-2+MMP-9组合获得的灵敏度最高(96.2%)，ESM-1+MMP-2组合获得的特异度最高(89.1%)。而ESM-1+MMP-2+MMP-9组合的诊断效能最优(AUC=0.928)。见表4，图2。

图1 ESM-1、MMP-2和MMP-9鉴别诊断良恶性胸腔积液的ROC曲线图

图2 ESM-1、MMP-2、MMP-9联合鉴别诊断良恶性胸腔积液的ROC曲线图

表3 ESM-1、MMP-2和MMP-9鉴别诊断良恶性胸腔积液的ROC曲线分析结果

表4 ESM-1、MMP-2和MMP-9联合鉴别诊断良恶性胸腔积液的ROC曲线分析结果

3 讨论

3.1引起胸腔积液的常见原因有肿瘤、结核、心力衰竭等疾病，在很长一段时间内，对于胸腔积液良恶性的鉴别诊断一直困扰着临床医师。由于良恶性胸腔积液的治疗及预后迥然不同，所以对其进行鉴别诊断具有重要的临床指导意义。但目前常用的各类检查方法都有其局限性，如细胞学检查其阳性率仅为50%左右；胸膜活检存在创伤性，阳性率为30.8%～76.0%，这些方法都不能较好满足临床需求，且临床上有20%～30%患者在常规的检测方法下仍难以明确胸腔积液的病因[13-14]。因此，探索具有更高灵敏度和特异度的指标以进行良恶性胸腔积液的鉴别具有重要意义。

3.2ESM-1是近年来发现的一种可溶性蛋白多糖，在调节细胞黏附、血管生成和肿瘤侵袭等过程中起着关键作用，其表达受血管生长因子、转录因子和细胞因子等多种因素的调控。ESM-1在多种肿瘤组织细胞均呈高表达，而在正常组织中表达偏低，可作为筛查恶性肿瘤的可靠标志物[15-16]。Kim等[5]研究发现，肾细胞癌患者血清ESM-1水平较正常组升高，并在肾细胞癌的发生、发展及转移过程中发挥着调控作用，与患者的临床病理特征和预后有密切联系。然而，Chen等[17]研究显示，下调ESM-1表达可以诱导癌细胞上皮-间充质转化、转移和侵袭。这与本研究结果不同，考虑可能与研究人群及标本的选择不同有关。目前国内外的研究主要针对患者的肿瘤组织、血液标本的ESM-1表达水平进行检测，鲜有研究针对胸腔积液进行研究。本研究结果显示恶性胸腔积液组的胸腔积液ESM-1表达水平显著高于良性胸腔积液组，且与患者的病理类型和T分期存在关联。

3.3MMPs是一类依赖Zn2+和Ca2+的内切蛋白水解酶，其主要作用是降解细胞外基质及基底膜。其中MMP-2、MMP-9能够降解细胞外基质、破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，使肿瘤细胞释放入血，在许多肿瘤患者的外周血及体液中都可以发现MMP-2、MMP-9升高[18-19]。细胞融合在癌症的发展中起着至关重要的作用，并导致涉及肿瘤转移的染色体和基因表达发生异常变化。有研究[20]指出，在肺癌细胞与间充质干细胞的细胞融合模型中，杂种细胞显示出更强的转移能力，同时MMP-2和MMP-9的表达水平也上升。Cao等[21]研究表明，支气管肺泡灌洗液和肺组织样本中MMP-2高表达与肺癌风险密切相关，其在预测肺部疾病的恶性方面显示出较高的灵敏度和特异度。本研究结果显示，恶性胸腔积液组的胸腔积液MMP-2和MMP-9表达水平显著高于良性胸腔积液组，且与患者的病理类型、T分期和远隔器官转移情况具有关联性，提示MMP-2和MMP-9在促进肿瘤转移、定植、生长中发挥重要作用。

3.4另外，本研究结果还显示，ESM-1、MMP-2和MMP-9均具有鉴别良恶性胸腔积液的诊断价值，其截断值分别为40.110 ng/ml、446.690 ng/ml和145.560 ng/ml，其中以MMP-2的诊断效能最优(AUC=0.894)。将其进行联合诊断，结果显示，MMP-2+MMP-9组合可获得的灵敏度最高(96.2%)，ESM-1+MMP-2组合获得的特异度最高(89.1%)，而ESM-1+MMP-2+MMP-9组合的诊断效能最优(AUC=0.928)。提示胸腔积液ESM-1、MMP-2和MMP-9联合检测有助于临床医师对其良恶性进行鉴别，及时调整患者治疗方案，改善预后。

综上所述，ESM-1、MMP-2和MMP-9可用于良恶性胸腔积液的鉴别诊断，三者联合检测可以提高诊断的灵敏度和特异度。但是本研究纳入样本量和肺癌病理类型较少，研究结论仍需进一步验证，ESM-1和MMPs在恶性胸腔积液发生、发展中的作用机制也有待探讨。