黄连素逆转人结肠癌细胞奥沙利铂耐药性的作用及机制

陈 琳， 李 卫， 黄国秀， 韦晓英， 刘 贺， 庞 羽， 罗珍玉， 蓝盈盈， 罗颖华

结肠癌是常见的消化道癌症之一，在全球癌症相关死亡原因中位列第三[1]，目前化疗是中晚期结肠癌的主要治疗形式。奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)是第三代铂类化疗药物，其毒副反应轻、疗效好，已广泛用于大肠癌和胃癌等治疗。然而，癌细胞耐药性的产生显著降低了OXA化疗的疗效[2]。黄连素(berberine,Ber)属于异喹啉类生物碱，可用于治疗癌症和消化、代谢、心血管和神经系统疾病[3]。近年研究发现，Ber既可逆转乳腺癌对多柔比星的耐药性[4]，还可增强胃癌对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)的敏感性[5]，提示Ber在逆转肿瘤耐药方面具有重要的作用。本课题组既往研究发现，添加Ber可以显著降低OXA对THC-8307/OXA细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，逆转了癌细胞对OXA的耐药性[6]。目前，关于Ber逆转结肠癌对OXA耐药性的机制研究报道较少，相关机制尚未明确。鉴此，本研究旨在探究Ber对人结肠癌耐OXA细胞(THC-8307/OXA细胞)耐药性的影响及其逆转机制，为Ber的临床应用提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1材料 THC-8307/OXA细胞(批号：WG102808)由中国科学院细胞库提供。DMEM培养基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Thermo Fisher公司。ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂盒购自北京Solarbio公司。OXA、Ber、鼠抗人P-gp(1∶1 000)抗体和鼠抗人GAPDH(1∶1 000)购自Sigma公司。兔单抗PI3K抗体(1∶1 000)、兔多抗p-AKT(1∶1 000)、兔单抗Akt抗体(1∶10 000)均购自Abcam公司。辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记羊抗鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗购于Santa Cruz公司。总RNA提取试剂盒购自天根公司。逆转录试剂盒和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒购自Takara公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养与分组 THC-8307/OXA细胞用含10%FBS的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2条件下培养，同时细胞培养液中添加2.5 μg/ml OXA维持其耐药性。分别添加不同剂量浓度的Ber干预细胞，依次分为Ber(5 μg/ml)+OXA组、Ber(10 μg/ml)+OXA组、Ber(20 μg/ml)+OXA组和OXA组，各组OXA终浓度均为20 μg/ml，同时设立对照组(细胞培养液仅含2.5 μg/ml OXA)。各组均于干预36 h后收集样品进行检测分析。

1.2.2 细胞形态学变化观察 在干预结束后采用日本尼康公司Ti2倒置相差显微镜进行细胞形态学观察并采集图片。

1.2.3 MTT法检测 取对数生长期的细胞以3.0×105cells/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。将10% FBS的DMEM培养液换成含Ber和OXA的培养液继续培养，按实验分组，每组设置3复孔，并设置空白对照孔，干预36 h后弃上清，加入90 μl含10% FBS的DMEM培养液和10 μl MTT溶液继续培养，4 h后弃上清，加入110 μl甲瓒(formazan)溶解液，于摇床上低速震荡10 min，使结晶充分溶解，酶标仪于490 nm测各孔吸光值(A值)，结果取均值。细胞存活率=[(干预组A值-空白对照组A值)/(对照组A值-空白对照组A值)]×100%。

1.2.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测 各组细胞经Ber和OXA干预后弃上清，灭菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2次，按总RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取，根据逆转录试剂盒操作说明书将RNA逆转录为cDNA，再进行RT-qPCR检测，各组均设置3个复孔。逆转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。RT-qPCR反应体系为20 μl，反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，引物序列见表1，实验重复3次，以2-△△Ct法计算其相对表达量。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot检测 应用放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液提取细胞总蛋白，以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法进行蛋白定量，以30 μg总蛋白上样量进行蛋白电泳，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)转膜后用5%脱脂奶室温封闭2 h，分别进行一抗孵育(4 ℃，过夜)，Tris-HCl缓冲盐溶液和吐温20(tris-buffered saline and tween 20,TBST)洗膜5次，5 min/次，分别孵育相应种属的HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜5次，增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)荧光显色。采用凝胶成像系统(上海天能，Tanon 5200)拍照，应用Image J软件分析条带灰度值。

1.2.6 细胞凋亡检测 消化细胞制备单细胞悬液，根据凋亡检测试剂盒说明，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，用结合缓冲液重悬，调节浓度为1×106cells/ml，取100 μl细胞悬液于流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC混匀，室温避光孵育10 min，再加入5 μl PI，室温避光孵育5 min，最后加入400 μl PBS混匀后应用流式细胞仪(美国BD Biosciences，BD FACSCantoTM Ⅱ)进行检测分析。

2 结果

2.1OXA联合Ber干预对THC-8307/OXA细胞形态的影响 显微镜观察结果显示，与对照组相比，OXA组细胞的生长状态和细胞形态无明显变化。Ber+OXA组细胞生长被抑制，细胞贴壁不牢，体积变小伴核固缩，胞质中黑色颗粒增加，培养基中细胞碎片增多，且随Ber浓度升高，抑制作用越明显。见图1。

ⓐ对照组；ⓑOXA组；ⓒBer(5 μg/ml)+OXA组；ⓓBer(10 μg/ml)+OXA组；ⓔBer(20 μg/ml)+OXA组图1 显微镜观察各组细胞形态所见(×100)

2.2各组THC-8307/OXA细胞存活率比较 与对照组相比，Ber联合OXA干预可显著降低THC-8307/OXA细胞的存活率(P<0.05)，但OXA组细胞存活率与之比较差异无统计学意义(P>0.05)。与OXA组相比，Ber+OXA组细胞存活率显著降低，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA组显著低于Ber(5 μg/ml)+OXA组，Ber(20 μg/ml)+OXA组显著低于Ber(10 μg/ml)+OXA组(P<0.05)。见表2。

表2 各组THC-8307/OXA细胞存活率比较

2.3各组THC-8307/OXA细胞凋亡率比较 与对照组比较，Ber联合OXA干预细胞组的凋亡率均显著升高(P<0.05)，但OXA组的细胞凋亡率与之比较差异无统计学意义(P>0.05)。与OXA组相比，各Ber+OXA组的细胞凋亡率显著升高，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA组显著高于Ber(5 μg/ml)+OXA组，Ber(20 μg/ml)+OXA组显著高于Ber(10 μg/ml)+OXA组(P<0.05)。见图2，表3。

表3 各组THC-8307/OXA细胞凋亡率比较

2.4各组THC-8307/OXA细胞的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表达水平比较 与对照组相比，Ber联合OXA干预细胞组的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，但OXA组的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表达水平与之比较差异无统计学意义(P>0.05)。与OXA组相比，各Ber+OXA组的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表达水平显著降低，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA组显著低于Ber(5 μg/ml)+OXA组，Ber(20 μg/ml)+OXA组显著低于Ber(10 μg/ml)+OXA组(P<0.05)。见表4，图3。

图3 Western blot检测THC-8307/OXA细胞P-gp蛋白的表达结果图

表4 各组THC-8307/OXA细胞的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表达水平比较

2.5OXA联合Ber对THC-8307/OXA细胞PI3K/Akt通路活化的影响 与对照组相比，Ber联合OXA干预细胞组的PI3K、p-Akt蛋白表达水平及p-Akt/Akt值显著降低(P<0.05)，但OXA组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与OXA组相比，各Ber+OXA组的PI3K、p-Akt蛋白表达水平及p-Akt/Akt值显著降低，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA组显著低于Ber(5 μg/ml)+OXA组，Ber(20 μg/ml)+OXA组显著低于Ber(10 μg/ml)+OXA组(P<0.05)。各组Akt蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5，图4。

图4 Western blot检测THC-8307/OXA细胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白的表达结果图

表5 各组THC-8307/OXA细胞的PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达水平及p-Akt/Akt值比较

3 讨论

3.1OXA是继顺铂(cis-platinum,DDP)、卡铂(carboplatin,CBP)后第3代水溶性铂类化合物，通过铂原子与DNA共价结合损伤DNA，破坏DNA修复，导致肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用，目前广泛应用于胃癌、肝癌和结直肠癌等癌症的治疗[7]。肿瘤细胞耐药常导致化疗药物胞内浓度降低而不能有效致死癌细胞，增加化疗失败风险。因此，寻找耐药靶点和化疗药物的增敏剂，研究药物逆转机制对提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性至关重要。

3.2Ber是一种异喹啉类生物碱，药理作用广泛，当与化疗药物联合应用时可辅助肿瘤治疗[8]。有研究证实，Ber与DDP联用，可通过激活caspase蛋白介导的凋亡通路诱导细胞凋亡，增强DDP对卵巢癌的化疗效果[9]，还可增强乳腺癌细胞MCF-7对DDP的敏感性[10]。另外，Ber还可通过下调p-STAT3和生存素(survivin)表达水平，提高5-Fu对胃癌的疗效[5]。此外，本课题组的既往研究[6]发现，通过20 μg/ml Ber对THC-8307/OXA细胞进行干预后可使OXA对细胞的IC50从3.019 μg/ml降低至0.148 μg/ml，提示Ber可显著提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转耐药。本研究结果显示，经过不同浓度Ber(5、10、20 μg/ml)的处理后，THC-8307/OXA细胞的细胞存活率显著降低，凋亡率显著升高，且随着Ber的浓度升高效应增强，提示Ber能显著提高结肠癌细胞THC-8307/OXA对OXA的敏感性，增强化疗疗效。

3.3耐药机制的产生与膜转运蛋白介导的药物外排、凋亡异常和调节细胞增殖的信号通路相关。有研究发现，肿瘤的耐药机制与P-gp蛋白表达增高有关[11]。P-gp蛋白作为膜转运蛋白的成员，是腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)依赖的药物外排转运体，由MDR-1基因编码，可将多种化疗药物泵出胞外，增加药物外排，降低药物胞内浓度，诱导肿瘤细胞耐药性的发生。P-gp蛋白介导的MDR是导致肿瘤化疗失败率升高的重要原因之一，抑制P-gp蛋白表达或蛋白活性可以减弱肿瘤耐药效应[12]。有研究证实，下调P-gp蛋白表达可显著增强人胶质细胞瘤对替莫唑胺的敏感性[13]。伍奕等[14]的研究也显示，在结肠癌细胞HCT-8/VCR中添加Ber抑制P-gp蛋白表达，逆转了长春新碱(vincristine,VCR)的化疗效果，提示Ber逆转肿瘤耐药的机制与P-gp蛋白相关。本研究结果显示，不同浓度Ber(5、10、20 μg/ml)联合OXA处理THC-8307/OXA细胞后，MDR-1 mRNA和P-gp蛋白的表达均显著下调，且表现出剂量依赖性，表明Ber可通过下调P-gp的表达，进而增强结肠癌细胞对OXA的敏感性。

3.4PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生中具有重要作用，Akt磷酸化促使靶基因激活，参与癌细胞增殖、存活、侵袭、转移和血管生成。而该通路异常激活也参与了卵巢癌、乳腺癌、肝癌以及结直肠癌等药物抵抗的发生[15]。另外，PI3K/Akt通路还可调控P-gp蛋白的表达，其下游核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)可通过与MDR-1启动子结合，启动MDR-1基因转录。研究指出，抑制Akt磷酸化可以降低NF-κB磷酸化水平，进而抑制MDR-1基因转录，降低P-gp蛋白等ABC膜转运蛋白表达水平，最终抑制P-gp蛋白介导的肿瘤耐药机制[16]。Zhang等[17]的研究显示，下调激肽释放酶11(kallikrein 11,KLK11)可阻断PI3K/Akt信号通路，逆转HCT-8/OXA细胞对OXA的耐药性。Yu等[18]的研究也提示，在HCT116/OXA细胞中，抑制PI3K/Akt通路可导致MDR-1 mRNA和P-gp蛋白的表达水平下调，从而逆转HCT116/OXA细胞对OXA的耐药性，表明抑制PI3K/Akt信号通路可有效逆转肿瘤细胞对化疗药的耐药性。本研究结果显示，不同浓度Ber(5、10、20 μg/ml)联合OXA干预结肠癌细胞THC-8307/OXA后，PI3K、p-Akt蛋白表达水平和p-Akt/Akt值显著降低，且Ber浓度越高下降越显著，表明Ber可有效抑制结肠癌细胞中PI3K/Akt信号通路，进而逆转THC-8307/OXA细胞对OXA的耐药性。

综上所述，Ber具有显著的抗肿瘤活性，可逆转THC-8307/OXA细胞对OXA的耐药性，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路，下调P-gp蛋白表达有关，进一步提示Ber可作为一种有效的化疗增敏剂以辅助结肠癌的化疗，值得深入研究。