针刀、电针对制动4周KOA兔模型股直肌-股二头肌肌肉状态及拉伸生物力学的影响*

史晓伟，乌云额尔顿，王东峰，王 彤，王春久，郭长青，史术峰△

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京中医药大学，北京 100029)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一种临床多见的以关节软骨破坏为典型病理特征的关节退行性疾病，KOA患者临床多表现为关节疼痛及膝关节活动障碍，且病情进行性加重[1]。膝关节是常见关节炎类型(髋、膝、腕)中最易受累的关节，尤其是中老年人更多见[2]。导致KOA的高危因素众多，膝关节异常的生物力在其中发挥着重要作用[3]，研究证实膝关节周围肌肉萎缩或无力与KOA疾病的发生与恶化密切相关[4]。临床中依据患者症状及疼痛程度，KOA可分为4期，即初期、早期、中期和晚期[2]，不同疾病分期治疗原则不同，但基础治疗被中华医学会骨科分会推荐适用于各期KOA患者[5]，主要包括：宣教、生活指导、科学锻炼以及中医药治疗、物理疗法等[5]，这其中，中医药治疗被推荐的方法有针灸、推拿[2-5]以及中成药、外用膏药等[5]。此外，2015年膝骨关节炎中医诊疗专家共识还进一步推荐了针刀疗法[6]。然而，针灸、针刀疗法是否适用于整个KOA疾病过程，目前尚无明确定论。笔者前期研究发现制动6周兔KOA软骨损伤大体符合中期以上程度，且发现电针、针刀具有改善肌萎缩的作用[7-9]，那么电针、针刀对早期KOA兔肌肉功能是否发挥积极治疗作用？因此，本研究探索电针、针刀对早期KOA兔股直肌-股二头肌萎缩状态及肌肉生物力学的影响，为电针、针刀治疗KOA提供实验结果支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只健康清洁级新西兰雄兔(6月龄，体质量2.5～3.0 kg)，购买同时饲养于北京金牧阳实验动物有限公司(动物生产许可证号：SCXK 2015-0005；动物使用许可证号：SYXK 2015-0008)。实验动物饲养环境符合动物伦理要求：单笼饲养;温度(22±2)℃;相对湿度(45±5)%;可自由获取食物和水。同时，本研究获得北京中医药大学动物伦理委员会批准，实验过程严格按照实验动物管理规定进行。

1.2 KOA兔模型制备

KOA兔造模的原理为下肢过伸位固定制动法(改良Videman法)，详细造模方法参照本团队前期报告[8-9]，简要步骤包括：①兔左后肢由助手被动拉直，后医用胶带(海氏海诺；青岛海诺生物工程有限公司)完全缠绕左后肢；②泡沫双面胶(上海得力文具有限公司)覆盖压敏胶带缠绕范围(从腹股沟及膝盖)；③树脂绷带(泰洲牌；揭西县泰洲医疗有限公司)完全缠绕泡沫胶范围1周；④高分子固定绷带(可耐特牌；苏州可耐特医疗科技有限公司)缠绕树脂绷带1周；⑤树脂绷带再固定,并用医用胶带捆绑；连续制动4周。这其中，泡沫双面胶发挥缓冲作用防止固定装置过紧压迫血管造成足水肿，树脂绷带-高分子绷带-树脂绷带发挥类似“石膏”的固定作用。

1.3 实验分组及干预方法

新西兰兔(30只)依据体质量，随机(随机数字表法)分为空白组(6只)和造模组(24只)，空白组正常饲养，造模组进行KOA兔造模。KOA兔制动4周后，解除固定，适应性喂养3 d，由两名研究者独立进行Lequesne MG膝关节功能评分(取平均值)，再随机分为模型组、针刀组、电针组和西药组(每组6只)。

1.3.1 空白组和模型组 给予纯水3 mL灌胃，1次/d。

1.3.2 针刀组 每日纯水3 mL灌胃，同时针刀干预每周2次，进针点如下：股内侧肌、股外侧肌肌腱止点、股直肌肌腱止点、股二头肌肌腱止点、鹅足腱囊以及局部压痛反应点、结节处，针刀体(0.35 mm×25 mm，喜灸牌小针刀)与皮肤切面(与肌纤维走行平行)垂直刺入，每次1～2刀，出刀后加压止血。

1.3.3 电针组 8个常用穴位分别为：血海、梁丘、委中、曲泉、阴陵泉、阳陵泉、内膝眼和犊鼻(参照《实验针灸学》进行取穴)，一次性使用无菌针灸针(0.2 mm×13 mm；环球牌)刺入10 mm，电极依次连接委中-梁丘组和血海-曲泉组(疏密波，频率2/100 Hz，电流2 mA)进行电刺激，每次20 min，隔天1次。

1.3.4 西药组 塞来昔布(西乐葆，辉瑞制药有限公司)溶于纯水灌胃治疗(10 mg/kg)，1次/d。

各组兔均干预治疗4周。

1.4 行为学评价

各组兔行为学评价依据改良Lequesne MG膝关节评估量表[10]进行，总评价共为4部分：疼痛、步态、关节活动度及关节肿胀程度(每项均依据严重程度分为0～3分)[8]。由两名研究者进行独立评价，取平均值进行统计学分析。

1.5 兔股直肌-股二头肌HE染色

干预治疗4周后，采用空气栓塞法处死新西兰兔。兔后肢置于冰盒，钝性分离股直肌和股二头肌，远端肌肉(靠近膝关节侧，1 cm长)置于4%多聚甲醛固定72 h，常规脱水处理后石蜡包埋，以5 μm为厚度进行肌肉组织病理切片。HE染色按照标准步骤进行[8]，简要流程：①组织切片60 ℃拷片30 min，二甲苯脱蜡，下行梯度酒精水化；②蒸馏水冲洗，苏木精染色5 min；③蒸馏水冲洗，1%盐酸乙醇浸泡5 s；④自来水冲洗10 min，1 %伊红染色2 min，蒸馏水冲洗；⑤组织切片常规进行脱水、透明，中性树胶封片。染色完成的肌肉HE切片在金相显微镜(BX60；日本奥林巴斯有限公司)下进行观察并拍照，数据分析提取应用Image J软件进行处理，以固定视野内肌纤维数和肌纤维平均横截面积两个指标进行统计学分析。

1.6 兔股直肌-股二头肌拉伸弹性模量检测

兔股直肌、股二头肌(余下的完整肌肉组织)肌肉拉伸弹性模量(Elasticity modulus, EM)应用动态疲劳试验机(ElectroForce3300；美国Bose公司)进行测试。肌肉样品制备：肌肉两端应用医用胶带完全包裹，然后迅速将肌肉两端浸入液氮中速冻(每侧10 s)，将冻硬的肌肉两端分别固定于模具卡中(远端肌肉头朝上)。试验机拉伸相关参数：拉伸长度20 mm(30 s)，自动生成应力-位移曲线。肌肉EM值由以下公式进行计算得出[8]，并进行统计学分析：

公式中，肌肉的横截面积由HE染色中计算得出；股直肌的原始拉伸长度为24.5 mm，股二头肌的原始拉伸长度为45 mm；位移均为20 mm。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组兔行为学结果比较

KOA兔干预治疗前各组兔 Lequesne评分比较：模型组、针刀组、电针组和西药组，各组间行为学评分差异无统计学意义(P>0.05)；干预治疗4周后，与模型组(4.67±1.12)比较，针刀(3.33±0.71，P=0.002<0.01)、电针(3.56±0.88，P=0.009<0.01)和西药(3.11±0.60，P=0.000<0.01)干预治疗可显著降低Lequesne行为学评分；针刀与电针治疗改善Lequesne评分组间差异无统计学意义(P=0.583)。见表1。

表1 各组兔行为学评价比较

2.2 各组兔股直肌-股二头肌HE染色结果比较

2.2.1 各组兔股直肌平均横截面积和纤维总数比较 在恒定视野内，与空白组比较，模型组股直肌平均横截面积显著减小(1.44±0.11)vs(2.02±0.36)×10-1mm2，P=0.000<0.01；干预后，与模型组相比，针刀[(1.89±0.12)×10-1mm2，P=0.000<0.01]、西药[(1.98±0.49)×10-1mm2，P=0.000<0.01]干预可显著增加股直肌平均横截面积，电针干预可增加股直肌平均横截面积但无统计学意义(1.63±0.29×10-1mm2，P=0.125)；针刀与电针比较，针刀干预促进股直肌平均横截面积更优(P=0.014<0.05)。

此外，与空白组比较，模型组恒定视野内模型组股直肌纤维总数[(173.08±11.19)vs(137.75±14.48)条，P=0.000<0.01]显著增多；干预后，与模型组相比，针刀[(140.35±15.81)条，P=0.000<0.01]、西药[(151.24±26.39)条，P=0.013<0.05]干预可显著降低股直肌纤维总数，电针干预可降低股直肌纤维总数但无统计学意义[(159.42±27.68)条，P=0.106]；针刀组与电针组比较，针刀干预降低股直肌纤维总数更少(P=0.014<0.05)。见图1A、表2。

表2 各组兔股直肌恒定视野内平均横截面积和肌纤维总数比较

2.2.2 各组兔股二头肌平均横截面积和肌纤维总数比较 在恒定视野内，与空白组比较，模型组股二头肌平均横截面积显著减少[(1.37±0.22)vs(2.30±0.30)×10-1mm2,P=0.000<0.01];干预后，与模型组相比，针刀[(1.88±0.32)×10-1mm2，P=0.000<0.01]、电针[(1.84±0.29)×10-1mm2，P=0.000<0.01]、西药[(1.96±0.46)×10-1mm2，P=0.000<0.01]干预可显著增加股二头肌平均横截面积；针刀与电针相比，两组股二头肌平均横截面积无统计学意义(P=0.691)。

此外，在恒定视野内，与空白组比较，模型组股二头肌纤维总数显著增多[(185.47±15.61)vs(115.94±10.59)条,P=0.000<0.01]；干预后，与模型组比较，针刀[(142.56±27.86)条，P=0.000<0.01]、电针[(144.05±20.78)条，P=0.000<0.01]、西药[(151.38±30.76)条，P=0.000<0.01]干预可显著降低股二头肌肌纤维总数；针刀组与电针组比较，两组股二头肌纤维总数无统计学意义(P=0.845)。见图1B、表3。

表3 各组兔股二头肌固定视野内肌横截面积和肌纤维数比较

注：分析过程所示为股直肌空白组图进行分析过程，左侧为固定视野内肌纤维数计数，右侧为固定视野内肌纤维总面积，肌纤维平均横截面积=总面积/肌纤维数。

2.3 各组兔股直肌-股二头肌拉伸弹性模型结果比较

弹性模量(EM)是衡量材料弹性变形难易程度的一种指标，可间接反应肌肉的结构性能。

2.3.1 各组兔股直肌拉伸弹性模量结果比较 与空白组比较，模型组股直肌整体EM值显著升高[(2.122±0.529)VS(0.878±0.269)MPa，P=0.000<0.01]；干预治疗后，与模型组相比，针刀组股直肌整体EM值显著降低[(1.202±0.583)MPa，P=0.002<0.01]，电针组股直肌整体EM值显著降低[(1.054±0.167)MPa，P=0.000<0.01]，西药组股直肌整体EM值显著降低[(1.164±0.291)MPa，P=0.001<0.01]；同时针刀组与电针组比较，股直肌EM值差异无统计学意义(P=0.565)。见图2、表4。

表4 各组兔股直肌弹性模量(EM)结果比较

2.3.2 各组兔股二头肌拉伸弹性模量结果比较 与空白组相比，模型组股二头肌整体EM值显著升高[(0.775±0.173)VS(0.401±0.141)MPa，P=0.007<0.01]；干预治疗后，与模型组相比，针刀组股二头肌整体EM值表达降低[(0.668±0.202)MPa，P=0.406]，电针组股二头肌整体EM值表达降低[(0.647±0.290)MPa，P=0.320]，西药组股二头肌整体EM值表达降低[(0.700±0.148)MPa，P=0.559]，但3组差异均无统计学意义；同时针刀组与电针组相比，股二头肌EM值差异无统计学意义(P=0.866)。见图2、表5。

表5 各组兔股二头肌弹性模量(EM)结果比较

注：左图为股直肌典型拉伸过程，右图为股二头肌典型拉伸过程。

3 讨论

KOA是全球范围内最常见的关节炎类型，随着全球人口老龄化程度的加剧，为各国带来沉重的经济和社会负担。黄洪容[11]对中国社区老年人KOA调查中发现60岁以上的老年人KOA发病率高达60.1%，因此中国KOA导致的相关经济负担也异常沉重。导致KOA的高危因素众多，异常生物力学因素在KOA的关键作用受到越来越多研究者的重视，目前国际上对KOA概念形成一种新共识，即膝骨关节炎是一种炎症和生物力学共同作用导致的全关节疾病[12]，这一认识更加突出了生物力学因素在KOA发病中的关键作用。关节周围软组织功能，尤其是肌肉状态是维持膝关节负荷最主要的因素。膝关节周围软组织，尤其是肌肉功能状态是维持膝关节有效负荷的重要因素，既往研究发现KOA患者存在膝周肌肉萎缩或肌力降低的临床表现，同时肌肉萎缩加速KOA的疾病进展[13]。因此，改善KOA患者膝周肌肉功能状态，是改善患者生活质量、延缓关节软骨退变的有效策略。

影响KOA患者生活质量的主要原因是膝关节疼痛及功能活动受限，因为众多国内外KOA治疗指南的治疗原则可概括为缓解疼痛、改善功能活动和延缓病程进展[14]。KOA的总体治疗策略包括非药物疗法、药物疗法及手术治疗，非药物疗法被众多指南首先推荐，针灸、针刀和推拿等中医外治疗法属于非药物疗法范畴，中华医学会骨科分会和风湿病分会建议使用针灸[5,15]，膝骨关节炎中医专家共识(2015)对针灸和针刀均有推荐[6]。KOA是中医骨伤科优势病种之一，属于中医“痹证”范畴[6]，有研究者对KOA病名的中医专家推荐程度调查发现，“膝骨痹”被认可度最高(66.7%)[16]。如果从KOA的症状表现来看，又符合中医“经筋病”范畴。刘乃刚等[17]提出经筋是肌肉、筋膜、韧带等软组织结构和功能的高度概括。《素问·五脏生成》曰:“诸筋者皆属于节”，指出经筋附着于骨骼上，同时《素问·痿论》提出:“宗筋主束骨而利机关也”，进一步阐述了筋与骨的关系，膝周经筋异常会影响关节活动，久病会导致“筋伤损骨”。针对这样的病机，郭长青教授提出“调筋治骨”治疗KOA的理念[7]，也正是本研究的出发点。考虑到针灸或针刀对KOA的操作部位，均位于膝周的肌肉、韧带等软组织(经筋部位)，因此其对KOA的治疗原理更多是通过缓解疼痛、改善肌肉功能状态而发挥治疗作用，其对膝关节软骨的作用更多的是间接治疗作用。

本团队前期研究发现兔下肢固定制动6周后其关节软骨损伤程度大致在中等程度以上[9]，同时伴有膝周的废用性肌萎缩现象。本研究应用过伸位制动法对兔下肢制动4周，发现其关节软骨损伤(Mankin评分)符合早中期程度(待发表)，同时发现制动4周后兔膝周股直肌、股二头肌出现明显肌肉萎缩现象，表现在HE染色固定视野内肌纤维横截面积减少及肌纤维数量增多。该结果与其他研究者应用制动法建立KOA模型结果相似[18]，制动所引起的肌萎缩属于废用性肌萎缩，临床中多见于需要长期卧床的慢性病患者及制动患者(如骨折)。经过针刀、电针干预后，针刀组KOA兔股直肌-股二头肌萎缩状态得到显著改善，电针组KOA兔股二头肌萎缩状态显著改善，股直肌萎缩状态有改善但无统计学意义。针刀对兔股直肌萎缩的改善较电针更佳。针刀、电针改善肌萎缩的机制可能不同，研究发现电针治疗KOA发挥复杂的镇痛机制[19]，同时单独电刺激具有改善肌萎缩的作用[20]；针刀治疗的部位主要在肌肉起止点、结节压痛点等，而肌肉起止点存在丰富的本体感受器[21]，针刀可能通过激活本体感受器同时破坏压痛点等从而发挥治疗作用。

肌肉内部结构的变化必然引起肌肉组织相关力学性能的改变。肌肉拉伸弹性模量，也称为“杨氏模量”，可以反映肌肉材料属性变化[22]。本研究结果显示模型组股直肌和股二头肌弹性模量(EM)值与健康兔肌肉相比明显升高，显示出模型组股直肌和股二头肌抵抗弹性变形更强，肌肉性能更韧。Wen等[23]应用超声剪切波检测萎缩肌肉的弹性模量，也发现同样的现象，即萎缩肌肉组织弹性模量增高。有研究发现萎缩肌肉的弹性模量升高可能与病变肌肉组织内纤维结缔组织增多或纤维化有关[23-24]。经过针刀、电针干预后，与模型组相比，针刀、电针组股直肌EM值显著降低，股二头肌EM值降低但无统计学意义。股直肌、股二头肌EM值出现这样的差异，其原因可能为在拉伸过程中，设置的拉伸位移为20 mm，此时股直肌基本均被拉断，而股二头肌因肌纤维较粗，没有被拉断，尚未达到其最大EM值，但这一设想需要后续实验进一步明确。

非甾体消炎药(NSAID)在KOA的管理中发挥重要作用，被国内外各临床指南所推荐，是药物疗法的首先推荐药物[5,14-15]。塞来昔布是NSAID的一种，具有消化道副作用小等优势，通过抑制COX、减少PG合成，降低外周神经敏化或疼痛强度，发挥镇痛作用[25]。本研究发现塞来昔布对萎缩肌肉具有改善作用，其根本原因可能正是通过解除疼痛对活动的限制、改善兔活动功能而间接发挥作用，Detrembleur等[26]也证实了塞来昔布对改善肌肉功能活动的有效性，但这一推断需要对兔活动功能量化来进一步证实。

综上，针刀、电针干预早期KOA兔具有改善膝关节功能的作用，直接改善股直肌、股二头肌萎缩状态，促进股直肌、股二头肌拉伸生物力学(尤其是股直肌)的改善。