散结通脉颗粒质量标准的建立

孙 尧，王艺璇，刘爱东，成光宇，张洪铭，解生旭，姜英子*

（1.延边大学药物分析教研室，吉林 延吉 133000；2.长春中医药大学附属医院实验中心，长春 130117；3.吉林省中医药科学院植化室，长春 130012）

散结通脉颗粒为国家名老中医、全国首届名中医、国务院特殊津贴获得者、长春中医药大学终身教授、吉林省著名中医心血管专家黄永生教授临床经验方剂制成的中药复方制剂，主要用于治疗痰瘀互结型冠心病心绞痛。制剂由丹参、水蛭等14 味药材组成。方中丹参、水蛭为君药，其功效是促进血液在血管中的流动，止血破血双向调节；三七、煅花蕊石助君药活血化瘀定痛，茵陈、泽泻、茯苓利湿化痰、透热泻浊，以上五味药共为臣药；砂仁与檀香有理气散寒止痛开胃之功，僵蚕和蝉蜕可防止瘀久成毒化热生风，四者共为佐药；枳壳、陈皮行气消痰，竹茹助枳壳、陈皮以涤痰开郁，脘痞自除，三者共为使药。本实验运用TLC 法对SJTM颗粒中丹参、水蛭、茯苓、泽泻、枳壳、陈皮进行定性鉴别，应用HPLC 法对丹酚酸 B 的含量进行定量测定，为有效控制制剂质量，完善质量控制标准，现将实验过程及数据结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010C 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）、KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）、电子天平（上海越平科学仪器制造有限公司）、GOODLOOK-1 000 型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）、Milli-Q（MERCK MILLIPORE）。

1.2 试药 丹酚酸B（批号：111562-201716，94.1%）、2，3-乙酰泽泻醇B（批号：111846-201705，99.7%）柚皮苷（批号：110722-201714，93.4%、110721-201617，96.1%）新橙皮苷（批号：111857-201703，99.2%）均购置于中国食品药品检定研究院。

散结通脉颗粒（批号：20190401、20190402、20190403）由吉林省中医药科学院的制剂室提供；水、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 丹参 取SJTM 颗粒5 g 研磨，加0.5%的盐酸溶液20 mL，超声30 min，除去沉淀，取澄清液体，液体用乙酸乙酯萃取（2 次，每次20 mL），将2 次萃取得到的上层溶液混合，蒸发至无溶剂，以蒸干物制成1 mL 的无水乙醇溶液为供试品溶液。取对照药材（丹参）2 g，与供试品溶液相同方法制得的无水乙醇溶液作为对照药材标准溶液。以每毫升含0.6 mg的丹酚酸B 甲醇溶液作为该药材的对照品溶液。照薄层色谱法[1]试验，在同一张硅胶G 板上对所制得的三种溶液进行各7 µL 的点样，在乙酸乙酯-甲苯-三氯甲烷-甲醇-甲酸（4:2:3:0.5:2）中进行展开，取出，挥干展开剂后均匀喷洒2%三氯化铁乙醇溶液作为显色剂，晾干，在105 ℃条件下加热至显色斑点逐渐清楚，在太阳光下观察[2]。被测颗粒的色谱图中，在与对照药材标准溶液和对照品溶液的色谱图对应的位置上，均存在显相同颜色的斑点，见图 1 。

图1 散结通脉颗粒丹参薄层鉴别

2.1.2 水蛭 取10 g SJTM 颗粒研磨，加乙醇60 mL，超声15 min，除去沉淀，取澄清液体将溶剂蒸干，以蒸干物制成的5 mL 的乙醇溶液，作为供试品溶液。另取对照药材（水蛭）1 g，向其中加入乙醇20 mL，与供试品溶液使用相同方法配置得到的乙醇溶液作为对照药材标准溶液。照 薄层色谱法[1]试验，在同一张硅胶G 板上对所制得的两种溶液进行各8 µL 的点样，在乙酸乙酯-环己烷（1:4）中展开，取出，均匀喷洒10%的硫酸乙醇作为显色剂，晾干，105℃下加热至显色斑点逐渐清楚，在太阳光下观察[6]。被测颗粒的色谱图中，在与对照药材 标准溶液色谱图对应位置上，均存在显相同颜色的斑点，见图2 。

图2 散结通脉颗粒水蛭薄层鉴别

2.1.3 茯苓 取SJTM 颗粒10 g，研成细粉，加入50 mL的石油醚（60℃～90℃），超声30 min，去除沉淀，取澄清液体，蒸发至无溶剂，以蒸干物制成的1 mL 甲醇溶液，作为供试品溶液。另取对照药材（茯苓）2 g，加20 mL 石油醚（60℃～90℃），与供试品溶液使用相同方法配置得到的甲醇溶液作为对照药材标准溶液。照薄层色谱法[1]试验，在同一张硅胶G 板上对所制得的两种溶液进行各10 µL 的点样，在石油醚（60 ℃～90 ℃ ）-甲酸-甲酸乙酯（15:1:5）中展开，取出，挥干展开剂，在紫外光灯（365 nm）条件下观察。被测颗粒色谱图中，在与对照药材标准溶液色谱图中对应位置上，均存在相同颜色的斑点，见图3。

图3 散结通脉颗粒茯苓薄层鉴别

2.1.4 泽泻 取SJTM 颗粒5 g，研磨成细粉，加入乙酸乙酯20 mL 作为溶剂，超声（功率300 W，频率40 kHz）30 min，去除沉淀，取澄清液体，使用氧化铝柱（200～300 目，5 g，内径为1 cm，干法装柱）进行吸附过滤，用10 mL 的乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液，蒸干其溶剂，以残渣制成1 mL 的乙酸乙酯溶液作为供试品溶液。另取对照药材（泽泻）2 g，加入20 mL 甲醇作为溶剂，超声30 min，去除沉淀，滤液置水浴蒸干甲醇，蒸干物制成1 mL 甲醇溶液，作为对照药材标准溶液。取对照品（2，3-乙酰泽泻醇B），制成2 mg/mL 的乙酸乙酯溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[1]，在同一块硅胶G 板上对对照品及对照药材标准溶液各2 µL、供试品溶液16 µL 进行点样，于乙酸乙酯:环己烷（1:1）中展开，夹出，挥干展开剂，均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液，在 105℃加热至斑点显色逐渐清楚，在自然光下观察。被测颗粒色谱图中，在与对照药材标准溶液和对照品溶液的色谱图中对应位置上，均存在显相同颜色的斑点，见图4。

图4 散结通脉颗粒泽泻薄层鉴别

2.1.5 枳壳 取SJTM 颗粒6 g，研磨成细粉，加30 mL甲醇作为溶剂，超声30 min，去除沉淀，取澄清液体将溶剂蒸干，将制成蒸干物制成甲醇溶液，作为供试品溶液。以0.5 mg/mL的柚皮苷、新橙皮苷的甲醇溶液，作为对照品溶液。取对照药材（枳壳）2 g，与供试品溶液使用相同方法配置得到的甲醇溶液，作为对照药材标准溶液。照薄层色谱法[1]试验，在同一张硅胶G板上对所制得的三种溶液进行各1 µL 的点样，在水-甲醇-氯仿（2:6:13）下层溶液中展开，夹出，挥干展开剂，均匀喷洒3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热1min，在波长为365nm的紫外光灯的条件下观察。被测颗粒色谱图中，在与对照药材标准溶液和对照品溶液的色谱图对应位置上，均存在相同颜色的斑点，见图5。

图5 散结通脉颗粒枳壳薄层鉴别

2.1.6 陈皮 取本品粉末8 g，加30 mL 甲醇作为溶剂，超声（功率300 W，频率40 kHz）30 min，取15 mL 上层清液，浓缩到1 mL，作为供试品溶液。另取对照药材（陈皮）2 g，加10 mL 甲醇作为溶剂，超声30 min，取上清液5 mL，浓缩到1 mL，为对照药材标准溶液。在甲醇中加入橙皮苷至不溶解，以上清液作为对照品溶液。照薄层色谱法[1]试验，在同一张硅胶G 板上对所制得的三种溶液进行各2 µL 的点样，在水-乙酸乙酯-甲醇（13:100:17）的条件下展开到约3 cm，再在甲苯-水-乙酸乙酯-甲酸（20:1:10:1）的上层溶液进行展开，展至约8 cm，取出，挥干展开剂，均匀喷洒3%三氯化铝试液作为显色剂，在紫外光灯（365 nm）的条件下观察。被测颗粒色谱图中，在与对照药材标准溶液和对照品溶液色谱图对应位置上，均存在显相同颜色的斑点，见图6。

图6 散结通脉颗粒陈皮薄层鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：SHIMADZU VP-ODS 柱（250 mm×4.60 mm，5μm）；流动相：以乙腈-0.1%磷酸溶液（22:78）；柱温：20℃；流速：1.2 mL/min；检测波长：286 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B 对照品适量，精准称取，制成34 μg/mL 的甲醇-水（8:2）的溶液，得到。

2.2.3 供试品溶液的制备 取SJTM 颗粒适量，研磨成细粉，精密称定，放入带有玻璃塞的锥形瓶中，准确量取甲醇-水（8:2）混合溶液50 mL 加入，加塞密封，称定重量，超声30 min，放凉至室温，再称定重量，用原溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，将续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取不含丹参的一日处方量，按方法（2.2.3 项下）制成阴性样品溶液。

2.2.5 专属性考察 分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，按方法（2.2.1 项下）测定，得到对照品、供试品、阴性对照各自的色谱图，见图7。在本条件下，样品色谱中丹酚酸B 的峰前后没有杂峰干扰，分离效果较好。

图7 散结通脉颗粒高效液相色谱图

2.2.6 方法学考察

2.2.6.1 线性关系的考察 取对照品溶液（2.2.2 项下），精密吸取1µL、2µL、4µL、8µL、16µL，注入液相色谱仪，按方法（2.2.1项下）测定。以对照品的量（X）为水平坐标，对照品的峰面积（Y）为垂直坐标，得丹酚酸B的回归方程为Y=847486.3615X-2168.1250，r=0.9999。结果显示，丹酚酸B在0.034～0.544μg范围中对照品含量与峰面积呈较好的线性关系。

2.2.6.2 精密度试验 取对照品溶液（2.2.2 项下），精密吸取10 µL，按“2.2.1 项下”色谱条件连续测定5次，结果丹酚酸B 的RSD 为0.60%，显示该仪器精密度较好。

2.2.6.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液（2.2.3 项下），准确吸取10 µL，按“2.2.1 项下”色谱条件在0、2、4、8、24 h 分别进样进行分析测定，结果丹酚酸B峰面积的RSD 为0.50%，显示供试品溶液在24 h 内基本稳定。

2.2.6.4 重复性试验 取同一批次SJTM 颗粒适量，按方法（2.2.3 项下）平行制备供试品溶液5 份，分别精密吸取10 µL，按“2.2.1 项下”色谱条件测定，结果丹酚酸B含量的RSD为0.14%，显示该方法重复性较好。

2.2.6.5 加样回收率试验 取已知含量SJTM 颗粒5 份（丹酚酸B 含量2.310 5 mg/g），分别精密加入丹酚酸B 对照品（1.25 mg/mL）1 mL，按“2.2.1 项下”色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。计算回收率，丹酚酸B 平均回收率为 98.24%，RSD=1.95%，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.3 样品含量测定 依上述含量测定项下方法，对3批样品中丹酚酸B 含量进行测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 mg/g

3 讨论

丹参薄层鉴别[2-4]曾以丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 混合溶液为对照，在三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6:4:8:1:4）及药典法中乙酸乙酯-石油醚（60℃～90℃）（1:4）的条件下分别展开过，但在阴性样品中丹参酮ⅡA 处存在干扰，所以只以丹酚酸B为指标，在甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:3:4:0.5:2）条件下展开；同时水蛭[5-6]、茯苓[7-8]、泽泻[9-10]、枳壳[11-12]、陈皮[13-14]均经过薄层方法学考察。

丹酚酸B 曾考察了不同的色谱柱、流速、柱温、流动相，不同的提取方法、溶剂种类、溶剂用量和提取时间，最终确定了准确可靠，稳定可行的方法，为后续质量标准的建立提供了较好的基础。