冰片增强依达拉奉对脑缺血再灌注损伤大鼠抗氧化作用研究

王文生·王月，陈 悦，贾红娥，郭冬梅

（1.乌鲁木齐市中医院南门医院心脑病科，乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学附属中医医院老年病科，乌鲁木齐 830001）

缺血性脑卒中（ischemia stroke，IS）是临床常见的脑血管系统疾病[1]。目前常以溶栓联合神经保护药物治疗，但溶栓可能会导致失语、半身不遂[2]。依达拉奉（edaravone）是一种氧自由基清除剂，在缺血性脑卒中治疗中应用广泛[3]。部分患者使用依达拉奉后仍存在神经功能损伤[4]。中医理论中脑缺血病机为“血行缓慢致瘀，瘀邪化热致毒，毒邪倾体以致脑神逆乱”。因此，缺血性脑卒中早期治疗应“芳香开窍，祛瘀散热”“祛除邪毒”[5]。且中西医联合是提高缺血性脑卒中患者治愈率的有效途径。冰片（borneol）为龙脑香科植物龙脑，多用于中风、痰热、神昏窍闭等证，具有“引药上行”“芳香走窜”的功效，常作为辅药以促进药物吸收[6]。因此，冰片联合依达拉奉治疗能够提高其抗氧化效果。本研究通过构建脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）模型，探讨冰片联合依达拉奉对I/R 的影响，为冰片配伍依达拉奉用于治疗缺血性脑卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 冰片（艾片，borneol，左旋龙脑，含量≥86.0%，湖北俊辉药业有限公司）；依达拉奉注射液（必存，江苏先声东元制药有限公司，批号：80190401）；L3200 大鼠线栓（200～240 g，广州佳灵生物技术公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，北京索莱宝公司）。MDA（malondialdehyde，丙二醛）试剂盒、SOD（superoxide dismutase，超氧歧化酶）试剂盒与GSH（glutathione，谷胱甘肽）试剂盒（上海酶联生物技术公司）；Anti-ZO-1（闭锁小带蛋白1）、Anti-Occludin（咬合蛋白）、Anti-Claudin-5（闭合蛋白5）、Anti-β-actin（β-肌动蛋白）抗体（北京博奥森生物技术公司）。

1.2 动物分组与给药 60 只SD 大鼠，由新疆医科大学动物实验中心提供，清洁级，雄性，7～8 周龄，体质量230～250 g，标准饲养环境。大鼠随机分为假手术组，脑缺血再灌注组，脑缺血再灌注加依达拉奉组，脑缺血再灌注加冰片组，脑缺血再灌注加依达拉奉加冰片组，每组12 只。脑缺血再灌注模型构建前3 天与构建后2 h，脑缺血再灌注加依达拉奉组与脑缺血再灌注加依达拉奉加冰片组尾静脉给药4 mL·kg-1依达拉奉，脑缺血再灌注加冰片组与脑缺血再灌注加依达拉奉加冰片组灌胃给药15 mL·kg-1冰片溶剂。

1.3 I/R 模型构建与神经功能评估 麻醉大鼠，自颈部开口，分离出颈外动脉与颈内动脉，将线栓插入颈总动脉，前进至颈内动脉约16～18 mm，固定线栓，缝合伤口。线栓插入2 h 后，取出线栓并结扎颈总动脉。假手术组仅麻醉后游离出颈总动脉。拔出线栓24 h 后，对各组大鼠神经功能评估。评分标准：0 分，行为正常；1 分，缺血对侧前肢无法伸展；2 分，缺血对侧前肢无法伸展，仅能向一侧转圈；3 分，向一侧转圈时侧推易跌倒；4 分，瘫痪。

1.4 脑梗死评估 取大鼠分离出全脑组织并冷冻成块，切成5 片约2 mm 厚切片，浸没于2 % TTC 溶剂中，避光孵育30 min，37 ℃。4% 多聚甲醛固定，按顺序排列后拍照分析。

1.5 脑水肿评估 取大鼠全脑组织，电子秤称重，记为湿重。干燥去湿，6 h 后称重，记为干重。脑水肿程度=[（湿重-干重）/湿重]×100 %。

1.6 血脑屏障完整性评估 取大鼠，皮下注射4 mL/kg伊文思蓝溶液。2 h 后处死，取缺血侧脑组织，加入2 mL 甲酰胺匀浆，离心（12 000 r·min-1，20 min），取上清液。在620 nm 波长下检测各个样品孔OD值，根据标准曲线，计算出各组样品蛋白含量。

1.7 氧化因子、炎性细胞因子检测 取大鼠缺血侧组织，加入PBS混合匀浆。12 000 r·min-1离心后取上清液，用于氧化因子或炎性细胞因子的检测。具体检测流程根据试剂盒说明书步骤开展。

1.8 血脑屏障相关蛋白检测 取大鼠缺血侧基底层组织，加入裂解液匀浆，离心取上清液，加入上样缓冲液，沸水浴变性。开展Western blot，并湿法转移凝胶上蛋白至PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭。使用一抗稀释液浸没PVDF 条带孵育过夜，再以二抗稀释液孵育。显影仪下显影获得蛋白条带，以β-actin 作为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学分析 实验数据采用SPSS 22.0 软件进行分析。实验结果用均数±标准差（）表示，各组数据之间采用单因素方差分析（One way Anova），各组数据两两比较采用Tukey检验。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（，n =12） 分

表1 各组大鼠神经功能评分比较（，n =12） 分

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜0.05

2.2 各组大鼠脑梗死体积占比比较 假手术组染色显示为红色，即无任何梗死区域；脑缺血再灌注组中缺血侧组织染色几乎全部为白色。见表2，图1。

表2 各组大鼠脑梗死体积占比比较（，n =12）

表2 各组大鼠脑梗死体积占比比较（，n =12）

注：与脑缺血再灌注组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

图1 各组大鼠脑梗死区域染色

2.3 各组大鼠脑水肿程度比较 见表3。

表3 各组大鼠脑水肿程度比较（，n =12）

表3 各组大鼠脑水肿程度比较（，n =12）

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.4 各组大鼠脑中氧化因子与抗氧化因子水平比较 见表4。

表4 各组大鼠脑中氧化因子与抗氧化因子水平比较（，n =12）

表4 各组大鼠脑中氧化因子与抗氧化因子水平比较（，n =12）

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.5 各组大鼠脑中炎性细胞因子水平比较 见表5。

表5 各组大鼠脑中炎性细胞因子水平比较（，n =12）

表5 各组大鼠脑中炎性细胞因子水平比较（，n =12）

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.6 各组大鼠脑组织中紧密连接蛋白表达与量化统计比较 见图3。与假手术组相比，脑缺血再灌注组中ZO-1、Occludin 与Claudin-5 表达水平明显降低（P＜0.01）。与脑缺血再灌注组相比，脑缺血再灌注加依达拉奉组与脑缺血再灌注加冰片组ZO-1、Occludin 与Claudin-5 表达增加（P＜0.05）。脑缺血再灌注加依达拉奉加冰片组ZO-1、Occludin与Claudin-5表达水平增加更明显（P＜0.01）。

图3 各组大鼠脑组织中紧密连接蛋白表达与量化统计比较

3 讨论

目前，静脉溶栓与神经保护药物联合使用是缺血性脑卒中主要治疗方式[7]，可帮助患者血流再通，但部分患者也会出现再灌注损伤[8]。本研究通过线栓法构建大鼠脑缺血再灌注模型。结果显示，脑缺血再灌注造成大鼠神经功能异常，脑组织中出现梗死区域。与此同时，构建模型的各组大鼠出现不同程度的水肿，以脑缺血再灌注组最为明显。此外，脑缺血再灌注导致大鼠脑组织中氧化因子、炎性细胞因子水平增加，抗氧化因子水平降低。以上结果提示本研究中脑缺血再灌注模型构建成功。

中医认为，缺血性脑卒中属于“血瘀证”，其特点为阻血滞气、伤神损络，治疗原则为活血化瘀，若清窍阻滞，则气血失于上行，水津失于输布，痰瘀邪毒蕴结。现代医学认为，大脑具有高能耗的特性，对缺血缺氧更敏感[9]。脑缺血再灌注会介导细胞膜中不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物[10]。如MDA 属于氧化应激最终产物，会造成蛋白质、核酸等大分子的交联聚合，产生细胞毒性，与中医理论中的邪毒一致。SOD 与GSH 是机体内清除氧自由基两种主要活性成分，组织内MDA、GSH 水平与SOD 活性可反映氧自由基损伤程度[11]。在氧化因子的攻击下，血脑屏障内皮细胞会出现不同程度损伤，细胞间紧密连接结构出现不同程度破坏，以紧密连接中ZO-1 蛋白、跨膜蛋白中Occludin 蛋白、Claudin 蛋白表达降低为特征[12]。在内皮细胞损伤情况下，微血管与脑实质器官会出现损伤，血脑屏障的开放程度增加，外周水分子进入造成脑水肿[13]。中枢炎性细胞因子在应激条件下的过度释放进一步加大血脑屏障开放程度，造成神经元坏死，出现局部的梗死区域[14]。生理条件下，体内会通过抗氧化应激系统清除多余的活性氧，避免MDA过量产生。但脑缺血再灌注过程中，机体内抗氧化系统功能无法完全抵御氧化应激的过度激活，因此需要外源性药物辅助治疗。

依达拉奉是一种氧自由基清除剂，研究显示依达拉奉基于Nrf2/HO-1 信号通路，诱导Akt 的激活，发挥抗氧化抗炎作用[15]。本研究中，依达拉奉降低了氧化因子MDA 水平，增加了抗氧化因子SOD 与GSH水平，降低了炎性细胞因子水平。然而，在大鼠脑组织梗死体积、脑缺血和神经功能的宏观指标中，依达拉奉无法完全逆转脑缺血再灌注造成的损伤。因此，脑缺血再灌注治疗需要联合给药促进依达拉奉发挥抗氧化功能。

中医常用配伍药物为冰片，具有“独行则势弱，佐使则有功”的特性。现代医学研究发现，冰片不仅能穿过血脑屏障，而且能改变血脑屏障通透性，促进其他药物透过血脑屏障。本研究中，冰片介导了脑组织中炎性细胞因子部分降低，对氧化应激因子具有一定抑制作用，但作用不明显。在依达拉奉配伍冰片的应用中，脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激因子、炎性细胞因子水平明显降低，抗氧化应激因子明显提高。在大鼠宏观指标中，与脑缺血再灌注组相比明显改善。

综上所述，冰片具有“通诸窍、散郁火”功能，用于脑缺血治疗具有部分疗效。冰片增强了依达拉奉抗氧化作用，提高了神经保护作用。这种配伍方式符合“相须相使”的配伍原则，值得在溶栓后抗脑缺血再灌注损伤治疗中应用。