挤压预处理酶解修饰大豆蛋白乳化特性的研究进展

朱秀清，刘燕清，朱 颖，姜永鹏，刘琳琳

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江省谷物食品与谷物资源综合加工重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

大豆不仅是全世界种植范围最广、营养价值最高的豆科植物之一，而且是重要的蛋白质来源。大豆中的蛋白质含量比谷类及薯类植物高，为40%左右，且富含人体所需的所有必需氨基酸，其营养和生物学价值可与动物蛋白媲美，可替代动物蛋白质在食品工业中的应用[1-4]。大豆蛋白是由多种L型氨基酸组成的大分子，由于其优异的两亲性和成膜性被广泛用作食品工业中的乳化剂。蛋白质作为表面活性分子可通过在空气-水/油-水界面处的吸附、展开和重排来有效地稳定泡沫和乳液[5-7]。乳化特性是大豆蛋白作为食品功能成分的重要功能特性，现代食品加工中需要乳化特性优良的大豆蛋白来发挥乳化剂的作用。与低分子质量乳化剂不同，天然大豆蛋白分子质量大、结构紧密，不能快速移动至界面完成有效吸附，导致乳化特性不够理想[8]。因此，为了获得具有更优良乳化特性的大豆蛋白，扩大其在现代食品加工中的应用范围，需要筛选合适的改性方法。

修饰大豆蛋白功能特性的方法主要有3 种，即物理、化学和酶解改性技术。酶解改性技术由于其反应条件温和、副反应及其产物少、水解程度易于控制而被广泛用于改善蛋白质功能[9]。蛋白质水解产物的理化和功能性质主要受水解度和蛋白酶种类的影响。许多研究表明，对球状蛋白质进行水解可提高其溶解度，暴露分子内部的疏水残基并减小分子质量，进而改善其乳化特性[10-11]。大豆蛋白中致密的三级和四级结构导致许多酶促位点被包埋，降低了酶解效果，而挤压预处理可改善蛋白质结构。有研究表明，物料经过挤压后，其酶促位点数量增加，有利于进行酶解处理，从而提升物料的水解度，导致所得水解产物的理化性质发生显著变化，说明挤压是有效促进蛋白水解的预处理方法之一[12-13]。

本文通过阐述挤压预处理、酶解修饰和挤压预处理联合酶解对大豆蛋白乳化特性的影响，为研究挤压预处理联合酶促过程改善大豆蛋白乳化特性的机制及生产应用提供理论支撑。

1 大豆蛋白的乳化特性

蛋白质分子的吸收、展开和复位速率会影响其乳化特性，而蛋白质分子内部自由能的减少和膜的流变性会影响乳液的稳定性。大豆蛋白分子中同时含有亲水和亲油基团，可以降低油相和水相的界面张力并促进乳状液的形成。形成乳状液后，乳化的油滴被聚集在其表面的蛋白质所稳定，形成界面膜，该界面膜具有位阻，可有效防止油滴的聚集和絮凝，有利于保持乳液的稳定。因此，大豆蛋白主要是通过降低水和油之间的界面张力来形成乳液，并通过在界面形成物理屏障来稳定乳液，所以大豆蛋白水解物良好的界面成膜性有利于发挥其乳化特性[14-15]。

1.1 影响大豆蛋白乳化特性的因素

1.1.1 内部因素

与其他乳化剂相比，大豆蛋白乳化特性更易受到可溶性蛋白的空间结构、变性程度、溶解性、疏水基团的分布（表面疏水性）和柔性等内部因素影响。

大豆蛋白的空间结构会影响其乳化特性，空间结构松散，隐藏在大豆蛋白分子内部的疏水性基团暴露，可有效提高蛋白在油-水界面和空气-水界面的吸附能力，从而提高乳化特性；反之，空间结构致密，疏水基团被隐藏在分子内部，导致其乳化特性不理想[16-18]。源博恩[19]发现，改性后的大豆蛋白空间结构发生改变，形成数量更多、体积更小的可溶性聚集体，能有效降低表面张力，从而提高其功能特性。

大豆蛋白的溶解性和表面疏水性是决定乳化活性的主要因素，而分子柔性对乳化稳定性至关重要。关天琪[20]发现，蛋白质乳化特性随表面疏水性的升高而提高，说明乳化特性取决于蛋白质的油水结合能力，与蛋白质的疏水残基有关。蛋白质的疏水基团能同时与油和水分子相互作用，从而在乳液形成过程中迅速吸收到油滴表面，达到改善其乳化特性的目的。表面疏水性、柔性分别是影响蛋白质表面活性的静态因素和动态因素。Zhu Ying等[21]通过研究大豆蛋白的柔性发现，7S球蛋白较11S球蛋白的柔性更好，柔性更好的蛋白质可确保多肽链骨架的解折叠，赋予它们出色的乳化特性。

1.1.2 外界环境因素

大豆蛋白的表面活性较好，可有效降低油-水界面的张力，并通过形成界面膜来稳定乳液，但大豆蛋白乳化特性除了受内部因素影响，还受加工方式、pH值、离子浓度、温度等外界环境因素所影响。

殷军等[22]发现，在不同加工条件下得到的大豆蛋白乳化特性差异较大，改性后大豆浓缩蛋白（soybean protein concentrate，SPC）和大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）的乳化特性均得到显著的提高。杨昱等[23]采用极端酸（pH 1～4）和极端碱（pH 10～13）处理SPI，发现极端酸碱处理会提高SPI的溶解性、表面疏水性和乳化特性。极端酸或极碱端处理均会使SPI的天然结构打开，促进蛋白质分子之间的相互作用，进而改善溶解性和乳化特性。孙燕婷等[24]经过研究发现，NaCl溶液会降低SPI溶解性和乳化特性；随着搅拌时间的延长和温度的升高，SPI的溶解性和乳化特性均先升高后降低。

1.2 大豆蛋白乳化特性的改性方法

化学改性、物理改性和酶解改性技术是大豆蛋白乳化特性改性的主要方法。可通过不同处理方法来改变蛋白质疏水基团的分布模式，进而改变其空间结构以达到改善大豆蛋白乳化特性的目的。不同处理方法有各自的优缺点，因此，选择合适的改性方法可以拓宽大豆蛋白乳化特性在食品工业中的应用。

化学改性因其安全性较低已较少使用。酶解改性是通过酶反应达到改变蛋白质分子的大小、空间结构，进而改善其乳化特性的目的。酶解改性的作用条件较为温和，对大豆蛋白结构的破坏较小，又能起到改善其乳化特性的作用，因此较为常用。物理改性主要是通过挤压、超声、超高压和热处理改变蛋白质天然结构和分子间聚集方式，达到改善其乳化特性的目的。物理改性具有安全性较好、成本较低、耗时短的优点。不同物理处理方法对SPI柔性和乳化特性产生不同的影响，但处理后SPI的乳化特性均随柔性的上升而上升[25]。天然大豆蛋白三、四级结构较为复杂紧密，仅用一种改性方法改善乳化性不能达到预期效果，两种方法综合使用更能显著提高乳化特性。

2 挤压对大豆蛋白乳化特性的影响

2.1 挤压对大豆蛋白的作用原理

挤压是常用的物理改性方法之一，挤压过程中产生的高温、高压和高剪切力会破坏大豆蛋白的天然结构，打开分子链，导致β-转角和无规卷曲含量增加，暴露出分子内部的疏水基团，在疏水相互作用、氢键、二硫键等非共价键的共同作用下形成分子质量较大的蛋白质聚集体，使蛋白质的溶解性降低，进而影响其乳化特性能，其大豆蛋白挤压机理如图1所示。Silva等[26]研究发现，在挤压过程中大豆蛋白游离巯基和总巯基含量增加，而二硫键含量下降。Beck等[27]用傅里叶变换红外光谱仪研究挤压温度和转速对蛋白构象影响发现，挤压过程β-转角含量增加，α-螺旋含量下降，但β-折叠（反向折叠）含量没有显著变化，因此聚集体的β-结构是维持其构象稳定的重要因素。

图1 大豆分离蛋白挤压机理图[28]Fig. 1 Conformational changes of soy protein isolate after extrusion[28]

2.2 挤压条件对大豆蛋白乳化特性的影响

挤压过程中物料水分、挤压温度以及螺杆转速等因素不同会导致蛋白变性程度和聚合程度不同，因此，蛋白挤出物具有不同的理化性质和结构特性，进而对乳化特性产生影响[29]。即蛋白质分子的变性程度与大豆蛋白的乳化特性密切相关，变性的程度由物料水分、挤压温度和螺杆转速等挤压条件所决定。

物料水分含量的增加，不仅会增强二硫键与氢键之间的相互作用，而且会增强二硫键与疏水相互作用之间的相互作用（P＜0.05）；与此同时还会减少聚集程度以及挤出机内不同区域之间蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质亚基之间的差异，这些结构的变化都对蛋白质的乳化特性起积极作用[30]。即增加水分含量对大豆蛋白乳化特性起积极作用。挤压过程中化学键的变化过程显示疏水相互作用、氢键、二硫键等非共价键共同维持挤出物的结构，并且非共价键起到维持挤出蛋白空间结构的主要作用。挤出过程蛋白质变性，大豆蛋白形成分子质量较大的蛋白聚集体，从而增加交联[31]。蛋白质通过机械剪切发生解离/解聚，机械能不断增加导致蛋白质聚集体解聚的程度增强[32]。在不同温度和剪切条件下，部分蛋白质发生变性将提高蛋白质的表面活性，表面活性的提高有助于在空气-水和油-水界面处吸收并形成界面膜，界面膜的形成有助于乳液的稳定。挤压过程中蛋白质的加热可能改变蛋白质表面亲水和疏水位点的分布模式，使隐藏在折叠结构中的疏水基团暴露出来，从而影响其表面活性和乳化特性[33]。

Mozafarpour等[34]研究发现，挤压处理降低SPC的溶解性和表面疏水性，与天然SPC相比，挤出的蛋白质α-螺旋结构比例降低，但β-螺旋结构比例增加。SPC挤压后在均质机内形成水包油乳液的过程中，均质处理施加的机械力会破坏热诱导聚集体，使其迅速移动至油-水界面上，完成有效吸附，并在液滴周围形成一层保护层，防止它们在碰撞过程中结合，利于提高大豆蛋白乳化特性[35]。均质化后，挤出的SPC结构中无规卷曲结构的比例显著增加，SPC的乳化特性得到改善。随均质压力不断升高，剪切作用力增强，蛋白质分子粒径降低，乳化特性得到改善；当均质压力大于35 MPa时，蛋白质分子受到的剪切效应和热效应过强，蛋白质发生不可逆变性，溶解性和表面疏水性降低，导致乳化特性降低[36-38]。还有研究表明，在均质过程中，除机械力外，其均质次数也会影响蛋白质结构和乳化特性。Xu Yeye等[39]研究发现，表面疏水性、柔性和乳化活性均随均质次数增加（0～3 次）而增加，但继续均质（3～4 次）其柔性、乳化特性的变化趋势不明显，表面疏水性继续增加。且有研究证明，大豆蛋白的柔性与乳化活性、乳化稳定性呈正相关[40-41]。

综上，挤压过程中的剪切效应和热效应使蛋白质发生不可逆变性，部分蛋白质裂解为多肽和氨基酸，造成分子内部疏水基团暴露，促进蛋白质分子之间的相互作用，利于蛋白酶进行水解作用，进而改善大豆蛋白的乳化特性。

3 酶解对大豆蛋白乳化特性的影响

酶改性技术通常是通过酶解反应对蛋白质分子作用，使大分子酶解成小分子，增加表面电荷、暴露分子内部的疏水基团，进而改变蛋白质的理化和功能特性[42-43]。一定程度的酶解促进蛋白质分子链的伸展，使蛋白质分子分解成小分子多肽，同时分子内部疏水基团暴露，促进蛋白质分子之间的相互作用，且随水解度的增加，大豆蛋白的溶解性和表面疏水性均增加，对蛋白质的乳化特性起积极作用。

3.1 影响酶解反应的因素

酶属于敏感物质，种类不同，其酶切位点和作用方式不同，对同一底物的水解效率不同。酶切位点的可及性会影响水解过程中肽的大小；酶的种类会影响酶水解产物的理化性质，蛋白质的结构性质和酶的特异性共同作用导致蛋白质功能性质发生改变。影响酶解的因素主要有温度、时间、pH值、底物浓度、加酶量，其中 pH值、温度和时间影响最大[44]。有研究报道，在适当温度下用微生物谷氨酰胺转氨酶对蚕豆蛋白分离物处理适当时间对蛋白的乳化特性起到积极作用；而处理时间过长和温度过高，乳液的乳化活性降低，这是由于表面疏水性过度增加，蛋白质加速氧化和液滴聚集[45]。

3.2 酶解改性对大豆蛋白乳化特性的影响

大豆蛋白的酶解改性效果与蛋白酶种类息息相关，选择合适的蛋白酶对酶解修饰大豆蛋白乳化特性非常重要。黄薇等[46]研究了6 种蛋白酶酶解大豆蛋白的过程变化规律，结果表明，碱性蛋白酶水解大豆蛋白的能力最强，可改善疏水性侧链基团的分布，利于提高大豆蛋白乳化特性。Alcalase限制性蛋白酶的水解作用有利于保持大豆蛋白的表面活性，对大豆蛋白的乳化特性起积极作用。因此，很多关于大豆蛋白乳化特性的研究都采用Alcalase水解。刘汝萃等[47]利用Alcalase水解SPI，发现SPI的溶解性随水解度增加而增加，溶解性增加对改善乳化特性起积极作用。已有研究证明，溶解性与乳化活性和乳化稳定性指数均呈显著正相关，即随溶解性增加，Alcalase水解SPI产物的乳化特性得到改善[48]。蛋白质溶解性、表面疏水性与其含有的疏水基团和亲水基团的比例、分布有关，溶解性增加也可能与小肽的形成有关。

大豆蛋白经过不同酶解时间得到不同水解度的水解物，水解度对大豆蛋白的乳化特性有一定影响[49]。适度水解利于SPI的表面活性改善和乳化特性的提高；而过度水解导致生成的多肽表面活性降低，不利于提高乳化特性。曹承旭等[50]对籽瓜种子进行酶解研究发现，不同酶解时间生成的产物水解度不同，水解度越高，乳化特性越好，且酶解4 h水解度最大，乳化活性最好，而乳化稳定性在酶解2 h 时最好，于爱华等[51]得到了相同的结论。不同水解度的蛋白水解物其功能性质有所不同，轻微水解对乳化稳定性不利，但低水解度大豆蛋白酶解液的乳化活性得到改善。Panizzolo研究发现，大豆分离蛋白酶解结束后降低pH值至2灭酶，得到的大豆分离蛋白水解物（soybean protein isolated hydrolysates，SPIH）比未灭酶处理组表现出更好的乳化特性。可能是因为通过酸处理使剩余的大豆蛋白发生解离和变性，有利于在界面处形成具有良好内聚力和黏弹性的薄膜。而微水解对冷冻停止酶反应的SPIH的乳化特性无益[52]。在不同乳液中，乳状液的稳定性与液滴粒径、液滴行为、界面蛋白浓度和界面膜的黏弹性密切相关。

单一酶解有利于改善蛋白质功能特性，但有时单一酶解改性会因为酶切位点被包裹在蛋白质分子内部而达不到预期效果，酶解之前对样品进行预处理能解决这一问题。李秋慧等[53]通过磷脂辅助酶法对SPI进行改性，发现在一定酶解时间内，磷脂酶解产物可通过促进乳化体系在水-油界面上形成稳定的界面膜提高乳液的稳定性。除此之外，李慧娜[54]通过超声波辅助酶解SPC，并对其乳液稳定性的影响进行研究，发现超声预处理后的SPC酶敏感性增强，乳化能力得到改善，效果较单独酶解或单独超声改性都好。常慧敏等[55]也采用超声波辅助酶解研究米糠蛋白的表面活性，发现超声波辅助酶解有利于改善米糠蛋白的溶解性和乳化活性，不利于提高乳化稳定性。物理改性和酶解法联合，除采用超声波辅助酶解外，也有关于挤压联合酶解修饰大豆蛋白乳化特性的研究，但现有报道较少。

4 挤压-酶解对大豆蛋白乳化特性的影响

天然大豆蛋白的三级结构非常紧密，蛋白质肽链上的肽键不易被水解，但经过挤压处理后，大豆蛋白分子被打开，暴露出更多隐藏在蛋白质内部的酶切位点，有利于水解，使得溶解性增加，进而改善其乳化特性。即挤压-酶解联合处理对大豆蛋白乳化特性起积极作用，其机理如图2所示。

图2 挤压-酶解大豆蛋白的乳化机理图[56]Fig. 2 Changes in emulsifying properties of soy protein isolate after extrusion-enzymatic treatment[56]

Clemente[57]发现酶解可以增强或降低大豆蛋白的功能特性和营养价值。Lamsal等[58]评价了酶解挤压大豆粉的功能特性，并证明了挤压过程影响大豆蛋白的功能和感官特性。Surówka等[59]发现大豆蛋白经挤压预处理后，其所有亚基都能被酶快速降解。挤压预处理与酶解修饰对大豆蛋白乳化特性及其他特性有协同增效作用，且无副作用。李杨等[60]采用挤压-酶解修饰SPI乳化特性，发现挤压预处理使大豆蛋白分子结构打开，暴露出更多的酶切位点，可促进SPI水解，有利于提高其水解度、溶解性和表面疏水性，进而达到改善大豆蛋白乳化特性的目的。Chen Lin等[61]的研究证实了挤压预处理会使大豆蛋白的天然结构破坏，进而暴露出更多酶切位点，有利于蛋白酶水解，从而改善其乳化特性。在酸性条件下，大豆蛋白乳化特性会有所下降，为提高酸性条件下的乳化特性，赵彩红等[62]采用挤压膨化与菠萝蛋白酶复合方法改性SPI，使得SPI乳化特性得到显著提高。综合目前挤压-酶解改善大豆蛋白水解产物功能性质的研究结果，挤压预处理协同酶解对蛋白的吸水性、溶解性均有促进作用，进而改善其乳化特性[63]。蛋白质良好的溶解性可促进其在水包油乳液界面迁移，包裹油滴形成物理界面层，与此同时表面电荷产生排斥力阻止聚集，有利于维持乳液的稳定状态。良好的溶解性是蛋白质形成稳定乳液体系的先天条件，当溶解性改善，乳化特性也得到一定程度的改善。蛋白质的表面疏水性可以反映蛋白质分子的聚集趋势和表面疏水基团的数量。亲水和疏水基团的平衡有利于提高大豆蛋白乳化特性，亲水性过强，颗粒吸附到油滴表面的能力减弱，会发生破乳现象；疏水性过强则会降低水溶性和表面活性[64]。Ma Wenjun等[65]以大豆蛋白为原料，采用挤压联合酶解的方式，考察大豆蛋白构象和功能变化。采用3 种挤压温度（60、80 ℃和100 ℃）预处理后进行酶解，发现挤压酶解处理显著改变了大豆蛋白的空间结构和功能特性，如二硫键数量急剧增加，巯基数量减少，并且随着挤压温度升高和水解时间的延长，大豆蛋白的持水性和溶解度增加。挤压处理有利于提高蛋白质的乳化活性，但会降低蛋白质的乳化稳定性。因此，大豆蛋白通过挤压预处理，不仅在挤压套筒内促进了蛋白-脂质复合体形成，同时更有利于蛋白酶对蛋白质挤出物进行水解，从而使其乳化特性得到明显改善。

综上所述，挤压预处理联合酶解改性改变了疏水基团的分布模式，显著改善大豆蛋白的乳化特性。挤压联合酶解方法是一种高效的球状蛋白功能修饰方法。

5 结 语

天然大豆蛋白结构较为复杂，大部分疏水基团被隐藏在分子内部，肽链折叠盘旋，形成致密球状结构，不利于酶解。对大豆蛋白进行预处理，可破坏其天然结构，暴露出更多的酶切位点，从而有利于酶解。挤压处理是一种高效的预处理方法，经过挤压预处理后的SPI分子链打开，暴露出被隐藏的酶切位点，利于酶解的进行，进而改善其乳化特性。因此，挤压联合酶解法是一种高效的球蛋白改性方法。大豆蛋白挤压预处理酶解修饰大豆蛋白乳化特性的研究有助于拓宽挤压辅助酶解处理在大豆蛋白相关食品体系中的应用领域。但目前此类研究还较少，其作用机理还有待进行更深入的研究。相信在不远的将来，随着新工艺技术的发展，必将大力推动挤压辅助酶解改性大豆蛋白在工业上的发展与应用。