小米麸皮水溶性膳食纤维-Cr(III)配合物的合成、表征及其体外抗氧化活性

全志刚，王维浩,2，赵姝婷，刘德志，王一飞，武云娇，苏有韬，魏春红，曹龙奎,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

小米是华北地区的重要粮食作物和主粮，其麸皮是一种廉价且易于获得的副产品，约占小米籽粒质量的6%～8%，其中含有50%～60%的膳食纤维[1-2]，还含有如多酚类、黄酮、木脂素等植物化学物质。谷物类膳食纤维是研究最广泛的一类膳食纤维，主要来自于各种农产品及其加工副产物。谷物麸皮层中富含膳食纤维，同时还含有胶质状葡聚糖，且不含植酸，是抗氧化膳食纤维的良好来源[3-4]。膳食纤维被认为是一类碳水化合物聚合物或低聚物，它们不能被小肠消化吸收，从而能够进入大肠被肠道菌群部分或完全发酵[5]。

2008年，Sánchez-Alonso等[6]提出抗氧化膳食纤维（antioxidant dietary fiber，ADF）这一概念，即将大量天然抗氧化剂结合到膳食纤维基质中所得产物。ADF按水溶解性的不同分为水溶性抗氧化膳食纤维和水不溶性抗氧化膳食纤维，其中，水溶性抗氧化膳食纤维中富含黄酮类、酚酸以及缩合单宁等天然抗氧化成分[4,7-8]，具有较好的抗氧化和降血脂等活性[9-11]。胡莉等[12]的研究表明花生秆水溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）有较好的自由基清除力和还原力，可作为抗氧化剂用于功能性食品的研发。姜龙波等[13]的研究表明小米糠水溶性非淀粉多糖中多酚和黄酮类物质含量丰富，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力稍低，但对·OH、O2-·清除能力以及Fe3+还原能力和Fe2+螯合能力均较高。研究表明三价铬离子（Cr3+）具有一定提高抗氧化性的能力。Fan Wentao等[14]研究发现给予鸡灌胃一定剂量Cr3+后，Cr3+可以诱导肝脏组织产生大量的抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等），从而提高总抗氧化能力。赵文苹[15]、兰明慧[16]等在奶牛基础日粮中添加酵母铬（主要含Cr3+），对受试牛群血液进行分析发现，谷胱甘肽过氧化物酶活力、超氧化物歧化酶活力和总抗氧化能力均提高，Cr3+的添加增强了机体的抗氧化功能。作为副产物的小米麸皮价格低廉，含有丰富的膳食纤维，小米麸皮SDF具有较好的水溶性，结构中含有大量的羟基、羧基等活性官能团，在一定条件下可以去质子化形成配体，具有较好的螯合金属离子的基础。因此，本实验以小米麸皮为原料，对其中SDF进行研究，由于膳食纤维与多糖具有相似的结构，所以利用碱性-氯化铬法对SDF进行修饰，得到铬螯合小米麸皮水溶性膳食纤维（selenium modified soluble dietary fiber，SDF-Cr(III)），并对螯合前后小米麸皮SDF采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）、原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）、高效液相色谱法分别分析修饰前后分子质量、颗粒形态、官能团、粒径分布和形态、单糖组成的变化；考察螯合前后SDF的体外抗氧化活性的能力，为今后的工业生产及功能性食品的研究开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米麸皮 黑龙江省大庆肇州托古小米厂。

α-耐高温淀粉酶（4万 U/mL）、中性蛋白酶（6万 U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（10万 U/mg） 美国Sigma公司；三氯化铬（CrCl3·6H2O）、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Aldpha1-2LD plus真空冷冻干燥机 德国Christ公司；RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；透析袋（截留分子质量3 500 Da）；GDE-CSF6膳食纤维测定仪（含GDE酶培养消化器和CSF6过滤装置）意大利VELP公司；FTIR仪 美国Thermo Electron公司；SU1510型SEM 日本日立公司；LC-20AD高效液相色谱、GPC-20A GPC仪、SPM-9500J3 AFM 日本岛津公司；TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱 日本TOSOH公司。

1.3 方法

1.3.1 小米麸皮SDF提取

称取5.0 g脱脂小米麸皮，按照料液比1∶50加入磷酸盐缓冲溶液，调节pH值至6.0（使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液，后同），加入100 μL耐高温α-淀粉酶，于GDE酶培养消化器中水浴培养25 min，样品温度保持在95～100 ℃。调节pH值至7.0，加入100 μL中性蛋白酶溶液，于GDE酶培养消化器中60 ℃条件下处理30 min。调节pH值至4.5，加入100 μL淀粉葡萄糖苷酶，于GDE酶培养消化器中60 ℃条件下处理30 min，用碘液检测直至不体系变蓝为止。灭酶（大于100 ℃、10 min），将酶解后反应物转移至CSF6过滤装置中，滤液经离心（4 000 r/min、20 min）、旋转蒸发浓缩到原液体积的1/4～1/5，然后用4 倍体积的体积分数95%乙醇溶液醇沉12 h（4 ℃），4 000 r/min离心20 min，-108 ℃冷冻干燥8 h得到SDF[17-18]。得到小米麸皮SDF含量为18.56 g/100 g。

1.3.2 小米麸皮SDF的纯化

准确称取小米麸皮SDF 0.5 g，加蒸馏水溶解至100 mL，采用Sevag法脱蛋白，按照V（正丁醇）∶V（三氯甲烷）＝1∶5配制Sevag试剂，加入SDF溶解液体积1/4的Sevag试剂，振摇10 min，离心弃去蛋白层，重复上述操作10 次[19]。用氨水调节小米麸皮SDF溶液pH值至8.5左右，加入体积分数30%双氧水50 mL进行脱色，于40 ℃下保温60 min，脱色后小米麸皮SDF溶液用旋转蒸发仪除去有机试剂，装入14 000 Da透析袋，自来水透析48 h后再用蒸馏水透析24 h。透析后，浓缩至一定体积，加无水乙醇使乙醇终体积分数达到80%，于4 ℃冰箱中醇沉过夜，再离心分离（9 000 r/min、5 min），沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，冷冻干燥（真空度0.095 MPa）至恒质量，即得纯化小米麸皮SDF，备用[20]。

1.3.3 SDF-Cr(III)配合物合成

根据Wang Cong等[21]的方法适当修改合成SDF-Cr(III)配合物。取5 g SDF于200 mL蒸馏水中，70 ℃水浴溶解（约20 min），向SDF溶液中滴加一定质量浓度的CrCl3溶液（7.2 mg/mL，共6.5 mL），用2 mol/L HCl溶液或2 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～10.0。在70 ℃下继续反应120 min。冷却后离心（5 000 r/min 10 min），经旋转蒸发浓缩上清液液为原体积1/4，加入3 倍体积95%乙醇，4 ℃纯沉6 h，离心取沉淀加入少量蒸馏水，透析（每6 h取少量透析液，调节pH值至9～10，加入2 mL质量分数30%过氧化氢检测游离CrCl3残留量，溶液无黄色时停止透析），冷冻干燥后获得SDF-Cr(III)配合物。

将上述冻干SDF-Cr(III)配合物1.0 g溶解于50 mL蒸馏水中，利用分光光度法（600 nm）定量Cr(III)[22]。用不同质量浓度CrCl3·6H2O标准溶液绘制标准曲线，计算Cr(III)的质量浓度。SDF-Cr(III)配合物的螯合率按式（1）计算。

式中：初始铬质量为滴加CrCl3的质量；非螯合铬质量通过CrCl3·6H2O标准溶液标准曲线计算得到。

1.3.4 扫描电子显微镜观察

使用SEM进行SDF和SDF-Cr(III)样品的形貌和微观结构研究。将冻干的SDF和SDF-Cr(III)样品放在双面胶带上并喷涂薄金层。在50.0 kV的加速电压下采集图像，SEM放大倍数为1 000[23]。

1.3.5 原子力显微镜观察

将SDF和SDF-Cr(III)分别用去离子水配制为质量浓度1 μg/mL。然后，将5 μL超声（100 W、3 min）分散后的上述溶液滴加到干净的云母片上，并在环境气压下干燥，使用AFM在室温下以Tapping模式获得SDF和SDF-Cr(III)的图像，并使用SPM-offline 2.2软件生成三维图像[24]。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱分析

使用FTIR仪进行分析，将SDF和SDF-Cr(III)（2 mg）分别与200 mg溴化钾粉末混合并压片，在4 000～400 cm-1范围内进行傅里叶变换红外光谱测定[24]。

1.3.7 分子质量及分布的测定

称取60 mg样品于10 mL容量瓶中，用流动相（0.1 mol/L NaNO3+质量分数0.06% NaN3-水溶液）溶解并定容。GPC条件：凝胶色谱柱为TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱，流速0.6 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL。

1.3.8 高效液相色谱分析

混合标准品溶液配制：精密称取适量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖标准品，加水溶解至各标准品质量浓度为50 μg/mL。

混合标准品衍生处理：精确吸取250 μL混合标准品溶液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH溶液、500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，70 ℃反应1 h。冷水浴冷却10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，再加入1 mL氯仿漩涡振荡1 min，3 000 r/min离心10 min，小心取上清液，重复上述步骤萃取3 次。上清液用于高效液相色谱分析。

待测样品水解：精密称取样品1.5 g至5 mL安瓿瓶中，加入2.0 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，封管，110 ℃酸解3 h，取出后于干燥箱（79 ℃）挥干三氟乙酸，加2.0 mL水复溶。

样品溶液衍生处理：精确吸取250 μL样品水解复溶液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH溶液、500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇，70 ℃反应1 h。冷水浴冷却10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，再加入1 mL氯仿漩涡振荡1 min，3 000 r/min离心10 min，小心取上清液，重复上述步骤萃取3 次。取上清液，即得衍生化样品。

色谱柱：Xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；进样量：20 μL（SDF溶液质量浓度1.24 mg/mL、SDF-Cr(III)溶液质量浓度1.46 mg/mL）；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 6.70）-乙腈（83∶17，V/V）。

1.3.9 体外抗氧化性分析

1.3.9.1 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率测定参照Li等[25]的方法并作适当修改。用无水甲醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，用去离子水将样品分别稀释为1、2、3、4、5、6 mg/mL，以VC溶液作为阳性对照。样品在室温下避光30 min，517 nm波长处测定吸光度，每个样品平行测定3 次。按式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中：A1为1 mL样品+2 mL DPPH-甲醇溶液的吸光度；A2为1 mL样品+2 mL甲醇的吸光度；A0为1 mL甲醇+2 mL DPPH-甲醇溶液的吸光度。

1.3.9.2 ABTS阳离子自由基清除率的测定

ABTS阳离子自由基清除率测定参照贾雨朦等[26]的方法并作适当修改。用2.6 mmol/L K2S2O8溶液配制获得7.4 mmol/L ABTS溶液，在室温下避光保存12 h，制得ABTS储备液。用磷酸盐缓冲液稀释ABTS储备液直至在734 nm波长处吸光度为0.70±0.02，1 h内用于测定。用去离子水将样品稀释为1、2、3、4、5、6 mg/mL，以VC溶液作为阳性对照，取0.2 mL样品溶液与1.6 mL稀释的ABTS储备液混合，暗处反应10 min，于734 nm波长处测定吸光度，每个样品平行测定3 次。按式（3）计算ABTS阳离子自由基清除率。

式中：A1为0.2 mL样品+1.2 mL ABTS稀释储备液的吸光度；A2为0.2 mL样品+1.2 mL无水甲醇的吸光度；A0为0.2 mL无水甲醇+1.2 mL ABTS稀释储备液的吸光度。

1.3.9.3 羟自由基清除率的测定

羟自由基通常通过Fenton反应产生[27]，其清除率测定参照Huang Xiaoqin等[28]的方法并作适当修改。称取一定量的待测样品，将其配制成质量浓度为1、2、3、4、5、6 mg/mL的系列样品溶液，备用待测。以VC溶液作为阳性对照，取1.0 mL待测样液，加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL体积分数0.5% H2O2溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，在37 ℃下水浴30 min，于510 nm波长处测定吸光度，每个样品平行测定3 次。按式（4）计算羟自由基清除率。

式中：A0为空白对照（不加样品）在510 nm波长处的吸光度；A1为待测样品在510 nm波长处的吸光度。

1.3.9.4 总抗氧化能力测定

采用铁离子还原能力法测定样品的总抗氧化能力，参照Benzie等[29]的方法并作适当修改。总抗氧化能力测定溶液由醋酸盐缓冲溶液（pH 3.6、300 mmol/L）、10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪（40 mmol/L盐酸溶液配制）和20 mmol/L氯化铁溶液以体积比10∶1∶1制备。用去离子水将样品分别稀释为1、2、3、4、5、6 mg/mL，取100 μL样液加入5.0 mL总抗氧化能力测定溶液，37 ℃水浴20 min，593 nm波长处测定吸光度，每个样品平行测定3 次。配制0.2～0.8 mmol/L FeSO4标准液，绘制标准曲线，以FeSO4浓度反映样品总抗氧化能力。

1.4 数据统计与分析

所有实验均进行3 次平行，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 22（Duncan法分析差异显著性）及Excel 2019软件对数据进行统计分析，用Origin 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 SDF-Cr(III)配合物的扫描电子显微镜观察结果

由图1可知，在相同放大倍数下，SDF-Cr(III)表面结构疏松，呈现出多孔性，显示出多孔的致密蜂窝状外观，SDF分子在弱碱环境下，链端或支链的官能团（如羟基、氨基、羧基等）会由于加入亲核试剂而脱水失去氢离子，形成孤电子基团，打破原有的分子稳定性，这时加入Cr3+后形成中心配位离子，从而形成稳定产物SDF-Cr(III)[29]；SDF呈团块状，表面较光滑，且无孔洞，表现出分层且紧凑的结构[30]，SDF是由葡萄糖为主要分子枝干形成的大分子结构，一般以氢键作用力形成片层链状。两者结构的变化可能归因于配位反应在碱性条件下糖苷键的断裂和Cr3+与游离出氢离子的SDF孤电子基团发生络合反应，产生更多小分子单糖、低聚糖或多糖，使SDF碎片化，发生Cr3+配位反应后，使SDF分子空化作用增强，从而暴露出更多活性基团，聚合成更小的多糖基团，使其结构变得疏松；初步推测SDF为2D片层结构经过络合反应解聚后重新聚集成3D螺旋状结构[31]。

图1 SDF（A）和SDF-Cr(III)SDF-Cr(III)配合物（B）SEM图Fig. 1 SEM images of SDF (A) and SDF-Cr (III) complexes (B)

2.2 SDF-Cr(III)配合物的原子力显微镜分析结果

AFM是一种可视化的扫描探针显微镜，是测定样品表面形态、粒径和分布的有力工具，这些指标与生物分子的功能特性相关[24,32]。SDF和SDF-Cr(III)的平面图像和三维AFM图像如图2所示。图2A1和图2B1分别展示了小米麸皮SDF和SDF-Cr(III)配合物的表面分子形态，结果显示小米麸皮SDF分子表面上有许多聚集体，而SDF-Cr(III)的分子表面上仅有少量的球状聚集体。图2A2、A3和图2B2、B3分别展示了SDF和SDF-Cr(III)的三维结构，SDF表面形貌崎岖不平，由许多个不规则的针状突起组成，这些突起的末端尖锐，表明SDF的结构单元和多糖类似，是相互分支和连接的。这与SEM观察结果相印证。但是，SDF-Cr(III)的表面形貌变得平坦，仅有一些零星的岛屿状突起，聚集度有所下降，分子间变得更加分散，这与Guo Yiting等[33]研究结论一致。基于这些形态学特性，推断由Cr3+引起的聚集变化影响了SDF的构象、分子质量和生物活性。

图2 SDF与SDF-Cr(III)配合物AFM图Fig. 2 AFM images of SDF and SDF-Cr (III) complexes

由图3可以看出，小米麸皮SDF聚集颗粒显示出较小的尺寸，高度集中在50～250 nm，络合反应处理SDF时，由于弱碱性使SDF解聚，和Cr3+发生配位聚集作用，在云母片表面形成了分布均匀且较大的纳米聚集体。SDF-Cr(III)颗粒的高度分布在50～350 nm。

图3 SDF与SDF-Cr(III)配合物高度分布的尺寸直方图Fig. 3 Height distribution of particle sizes of SDF and SDF-Cr (III) complexes

2.3 SDF-Cr(III)配合物的傅里叶变换红外光谱分析结果

小米麸皮SDF和小米麸皮SDF-Cr(III)配合物的FTIR如图4所示，小米麸皮SDF在3 340 cm-1附近的宽吸收峰归因于羟基的伸缩振动[34]，然而，SDF-Cr(III)配合物在3 340 cm-1处的吸收峰有所减弱并蓝移至3 364 cm-1处，推测小米麸皮SDF分子上的羟基可能参与和Cr3+配位，导致羟基形成分子间和分子内氢键能力减弱[35]。此外，小米麸皮SDF-Cr(III)配合物的FTIR在530.27 cm-1出现Cr—O的特征吸收峰[36]。小米麸皮SDF在2 923 cm-1附近出现一个较弱的吸收峰，这是由υ（C—H）伸缩振动所引起，而在1 395 cm-1处的吸收峰是由σ（C—H）的伸缩振动所引起。1 617 cm-1处的吸收峰可能与C＝O或σ（—OH）伸缩振动有关[21]，然而，SDF-Cr(III)在1 617 cm-1处的吸收峰明显有所减弱，且蓝移至1 634 cm-1，推测C＝O或σ（—OH）可能与Cr3+发生配位反应。SDF在1 089 cm-1处出现吸收峰，是由C—O—C中C—O的伸缩振动和C—O—H的O—H变角振动所引起[37]，表明小米麸皮SDF由吡喃糖苷组成，并且SDF-Cr(III)在1 089 cm-1处的吸收峰有所减弱，红移至1 100 cm-1处，推测C—O—C中的C—O或C—O—H的O—H在碱性环境中形成孤电子基团，与Cr3+发生配位反应。以上FTIR结果可以说明小米麸皮SDF的化学官能团和多糖类物质及其相似，和多糖一样能够发生铬离子螯合反应[38]。

图4 SDF、SDF-Cr(III)配合物傅里叶变换红外光谱扫描图Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of SDF and SDF-Cr(III) complexes

2.4 SDF-Cr(III)配合物的分子质量分布分析结果

由图5可看出，SDF和SDF-Cr(III)在17 min前都有两个主要组分的峰（17 min以后的峰是容器或溶剂中的小分子杂质峰，不在有效范围内，故不作考虑），SDF在保留时间为13.393 min时出现第一个峰，峰所占面积为13.65%，分子质量为2.43×104Da；保留时间为15.199 min时出现第二个峰，峰所占面积86.35%，分子质量为0.2×104Da。SDF-Cr(III)在保留时间为13.487 min时出现第一个峰，峰所占面积94.39%，分子质量为2.14×104Da；保留时间为15.155 min时出现第二个峰，峰所占面积5.61%，分子质量为0.21×104Da；综上可知，SDF和SDF-Cr(III)都包含两部分峰，SDF中分子质量0.2×104Da占主体，分子质量2.43×104Da占少数，而SDF-Cr(III)配合物分子质量2.14×104Da占主体，分子质量0.21×104Da占少数，说明在络合反应之前，SDF分子以链状多分支结构连接，而络合反应以Cr3+为中心离子发生配位后，使SDF分子聚集在一起，形成三维结构更强的分子结构。也可能是弱碱性的环境使SDF大分子发生糖苷键断裂，降解为更多可溶性小分子，当加入Cr3+后，与其发生络合反应。

图5 SDF（A）和SDF-Cr(III)（B）配合物的凝胶柱图谱Fig. 5 Gel permeation profiles of SDF (A) and SDF-Cr(III) complexes (B)

图6为小米麸皮SDF和SDF-Cr(III)配合物的分子质量分布结果。修饰前后小米麸皮SDF各有两个组分，分别为10.11×104～0.52×104、0.64×104～0.03×104Da和306.88×104～0.05×104、27.33×104～0.34×104Da。

图6 SDF（A）与SDF-Cr(III)配合物（B）的分子质量分析图Fig. 6 Molecular mass analysis of SDF (A) and SDF-Cr (III) complexes (B)

表1为修饰前后小米麸皮SDF的分子质量分布结果。为了比较SDF和SDF-Cr(III)配合物之间的变化，主要看整体峰（不分峰）分子质量的变化，出峰越早，分子质量越大，计算得到SDF的mn＝0.195×104Da、mw＝0.940×104Da、D＝4.81，SDF-Cr(III)的mn＝0.742×104Da、mw＝4.708×104Da、D＝6.35。由分布宽度指数D可知该组分在这一范围内分子质量的分布宽度及是否分散均匀，D＜10时，是均一分子质量的聚合物，D＞10且越大表明其分子质量分布越宽，分散程度越大，由SDF和SDF-Cr(III)分布宽度指数D可知，SDF-Cr(III)分子质量偏大的分子占主体，分布较宽；然而分子质量较小的分子分布宽度指数接近1，分布较窄；这和分布曲线和微分曲线对应，近似正态分布。从各峰分布宽度指数可以看出都小于10，分子质量分布较均匀[39]。

表1 SDF与SDF-Cr(III)配合物分子质量测定结果Table 1 Determination of molecular masses of SDF and SDF-Cr (III) complex

2.5 单糖组成分析结果

由图7可知，两种SDF单糖种类未发生明显变化，单糖物质的量比有明显变化，主要的单糖分别为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、木糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖（SDF-Cr(III)中未检测出）、葡萄糖醛酸。如表2所示，SDF-Cr(III)中每一个单糖相对含量比SDF都有所增加，其中，葡萄糖相对含量增加4.11%、半乳糖相对含量增加4.49%、甘露糖相对含量增加1.08%、阿拉伯糖相对含量增加2.12%、半乳糖醛酸相对含量增加0.65%、木糖相对含量增加2.12%、鼠李糖相对含量增加0.41%、核糖相对含量增加0.19%、葡萄糖醛酸相对含量增加0.37%，但是改性后SDF-Cr(III)配合物中没有岩藻糖，可能是其参与了反应，发生降解。造成这种情况的可能原因是螯合反应在弱碱性条件下既破坏了SDF分子中双糖、寡糖、多糖的糖苷键，溶解出更多的水溶性小分子单糖、低聚糖或多糖，又使SDF分子中羟基、羧基、氨基等官能团游离出氢离子，形成孤电子基团，与Cr3+发生配合反应，从而增加了单糖的相对含量。这与张聪[40]对苦瓜多糖-Cr(III)配合物的研究结果一致。此外，结合分子质量显著增加（从0.940×104Da达到4.708×104Da）的结果，初步表明成功合成了一种新型小米麸皮SDF-Cr(III)配合物。

表2 SDF与SDF-Cr(III)配合物单糖含量Table 2 Monosaccharide contents in SDF and SDF-Cr (III) complexes

图7 混合标准品（A）、SDF（B）与SDF-Cr(III)配合物（C）高效液相色谱图Fig. 7 High performance liquid chromatograms of mixed monosaccharide standards (A), SDF (B) and SDF-Cr (III) complexes (C)

2.6 体外抗氧化能力分析结果

由图8可知，小米麸皮SDF-Cr(III)配合物DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除率以及总抗氧化能力都显著高于SDF。其中，当VC质量浓度最低时，DPPH自由基清除率和羟自由基清除率已经达到最高。当质量浓度最高时，SDF-Cr(III)对DPPH自由基清除率和羟自由基清除率分别达到78.6%、92.45%，ABTS阳离子自由基清除率和总抗氧化能力分别达到68.42%、0.68 mol/mL。因为SDF-Cr(III)配合物由单糖组分可知较SDF有更多的还原糖和糖醛酸，同时SDF-Cr(III)配合物结构疏松多孔。Yan Jingkun等[41]认为SDF的抗氧化活性与碳水化合物中的还原糖、糖醛酸含量、分子质量大小以及结构有关。总抗氧化能力测定结果表明，当质量浓度达到最大时，SDF和SDF-Cr(III)的FeSO4当量浓度分别为0.34、0.68 mol/mL，SDF-Cr(III)的总抗氧化能力显著高于SDF。这可能与半乳糖和岩藻糖的含量有关，这与张启月[42]的研究结论一致。Su Yue等[43]证实4 种木耳多糖的岩藻糖和半乳糖含量会同时影响样品的总抗氧化能力，并且总抗氧化能力与岩藻糖含量显著负相关，与半乳糖含量负相关。结合自由基学说，岩藻糖和半乳糖含量增多，导致自由基累积，自由基过氧化反应增强，抗氧化作用失衡，引起氧化应激。SDF-Cr(III)配合物中Cr3+具有清除活性氧或活性氮等自由基能力，从而可以提高某些酶活力，间接提高总抗氧能力。制备SDF-Cr(III)配合物的目的是引入活性因子Cr3+，清除累积的自由基，从而达到缓解氧化应激，提高总抗氧能力的目的。

图8 SDF与SDF-Cr(III)配合物体外抗氧化能力Fig. 8 In vitro antioxidant capacity of SDF and SDF-Cr (III) complexes

3 结 论

本研究合成得到了小米麸皮SDF-Cr(III)配合物，利用SEM、FTIR、AFM对小米麸皮SDF和SDF-Cr(III)配合物进行结构表征。SEM结果表明：SDF呈团块状，表面较光滑且无孔洞，表现出分层且紧凑的结构；SDF-Cr(III)表面结构疏松，显示出具有多孔的致密蜂窝状外观。AFM结果表明：SDF的表面形貌崎岖不平，由许多个不规则的针状突起组成，表面形貌变得平坦，有一些零星的岛屿状突起，聚集度有所下降，分子间变得更加分散均匀；SDF颗粒的高度为50～250 nm，SDF-Cr(III)颗粒的高度为50～350 nm。FTIR结果表明：羟基、酯基、羰基等活性官能团伸缩振动减弱，特征吸收峰位置发生蓝移，在530.27 cm-1处有Cr—O伸缩振动，表明SDF与Cr3+结合形成配合物。采用常温GPC和高效液相色谱分析了小米麸皮SDF和SDF-Cr(III)配合物分子质量分布及单糖组成，结果发现：SDF与Cr3+发生配位反应后，SDFmn＝0.195×104Da、mw＝0.940×104Da、D＝4.81，SDF-Cr(III)mn＝0.742×104Da、mw＝4.708×104Da、D＝6.35，表明SDF分子聚集在一起，形成三维结构更强的分子结构；SDF-Cr(III)单糖相对含量高于SDF。体外抗氧化实验表明，SDF-Cr(III)具有较好的DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、羟自由基清除能力和总抗氧化能力。综上，初步认为小米麸皮SDF-Cr(III)配合物具有进一步研究的价值，可用于开发降糖医药保健品。