肝细胞癌的血管正常化与免疫治疗

余贤哲，朱玲玲，李建国△

原发性肝癌主要包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC），其中HCC为大多数国家原发性肝癌最常见的病理类型，也是全球第五大常见癌症，是世界癌症相关死亡的第二大原因，每年约有60万人死于该病［1-2］。大部分HCC 起源于慢性肝脏疾病，尤其是慢性肝炎病毒感染，如丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒［3］。手术治疗被认为是HCC 唯一的“根治性治疗”方法，但80%的患者在诊断时已失去手术的机会［4］。对于无法手术切除的HCC，免疫治疗是一种颇有前景的抗肿瘤策略，可通过增强机体免疫反应，激发肿瘤特异性免疫，打破免疫耐受，从而达到延缓肿瘤进展的目的［5］。美国食品药品监督管理局（FDA）先后批准了几种免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）用于治疗肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤，但免疫治疗的总体客观有效率仅20%～30%［6］。血管生成对肿瘤进展至关重要，抗血管生成治疗可通过靶向血管内皮生长因子（VEGF）及其受体VEGFR 通路来实现抑制肿瘤生长［7］。免疫治疗和抗肿瘤血管生成之间存在相互调节的作用，为提高HCC疗效，增强对疾病的长期控制，两者的联合治疗成为更有吸引力的策略。

1 肝脏的免疫微环境

肝脏30%的血供来自肝动脉，其余70%来自门静脉系统，该系统血液中携带大量的食物成分及微生物抗原，使肝脏不断暴露在各种非致病性抗原之中，为防止自身免疫性肝损伤，肝脏微环境持续表现为免疫抑制［8］。肝脏的免疫微环境由多种类型细胞组成，包括肝窦内皮细胞（LSECs）、肝星状细胞（HSCs）、枯否细胞（KCs）、树突状细胞（DCs）和淋巴细胞。这些细胞与肝实质细胞一起调节机体的免疫功能，参与HCC 的免疫应答与免疫耐受［9］。LSECs是肝窦内常见的抗原提呈细胞（APCs），通过组织相容性复合物（MHC）Ⅰ和Ⅱ的表达启动幼稚CD4+T和CD8+T 细胞［10］。KCs 是肝脏血窦中的巨噬细胞，不仅能维持免疫应答的稳态，还能通过其抗原提呈功能，与LSECs 共同构成门脉系统的第一道免疫屏障［11］。这些特殊的免疫抑制细胞群保护肝脏免受外来抗原引起的免疫损伤，诱导机体产生免疫耐受，使肿瘤细胞处于高度免疫抑制的微环境中，这也造成了肿瘤的免疫逃逸［12］。肝脏慢性炎症和血管生成是建立免疫逃逸机制的关键，对于HCC的形成与进展至关重要［13］。慢性炎症与免疫抑制肿瘤微环境相关，免疫治疗不直接针对肿瘤细胞，而是针对患者的免疫系统或肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），TME 是肿瘤细胞赖以生存的细胞环境，由多种基质细胞类型组成，包括免疫细胞、炎症细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等［14］。HCC 患者特异性T细胞介导的细胞免疫反应往往处于低下状态，T 调节细胞（Tregs）是抗肿瘤T 细胞的负调控因子，抑制CD8+T 细胞的增殖分化，与HCC 进展和不良预后相关。骨髓来源的抑制细胞（MDSCs）是未成熟的髓细胞，具有免疫抑制和促血管生成活性，在HCC 免疫逃逸中起关键作用［15］。这种免疫微环境存在于HCC发生和进展过程中，使免疫治疗成为HCC治疗的一个新方向。

2 免疫治疗在HCC的应用

目前免疫治疗主要包括ICIs、基因疗法、疫苗、过继细胞疗法，其中ICIs 已被批准用于HCC 的治疗［16］。免疫检查点可以抑制T 细胞的功能和增殖，促进肝脏免疫耐受。ICIs 可阻断其对T 细胞的抑制作用，增强对肿瘤细胞的杀伤作用［17］。ICIs 也可以阻断与T 细胞相互作用的细胞负调控信号，从而维持细胞的抗肿瘤免疫。目前已被用于HCC 治疗的ICIs 主要有细胞毒性T 细胞相关抗原4（CTLA-4）、程序性死亡受体（PD-1）和程序性死亡受体配体（PD-L1）阻断剂［18］。

2.1 CTLA-4 单抗 CTLA-4 受体是一种负性免疫调节因子，通过与CD28竞争性地结合CD80和CD86分子而下调T细胞的免疫应答，上调Tregs细胞的黏附力和运动性等多种功能来抑制T 细胞的活性。CTLA-4 抗体将T 细胞从抑制信号中释放并重新激活，刺激免疫细胞的活化、增殖，从而诱导或增强免疫反应并恢复其抗癌作用［19］。在HCC 治疗中的第一个CTLA-4 单抗药物是Tremelimumab，它是一种全人源单克隆抗体，可与活化T 淋巴细胞表面的CTLA-4结合，具有良好的抗肿瘤活性和安全性。一项关于CTLA-4 单抗的研究纳入32 例HCC 晚期患者，结果显示部分缓解率为26.3%，14例可定量丙型肝炎病毒（HCV）的患者中有12 例病毒载量显著下降；患者6个月和12个月HCC无进展生存的概率分别为57.1%和33.1%，中位进展时间（MTTP）为7.4个月，中位总生存时间（MST）12.3 个月，该研究表明Tremelimumab 能够阻断肿瘤造成的免疫抑制通路，激活全身免疫系统，还具有抗病毒效应，对合并有病毒性肝炎的HCC患者益处更多［20］。

2.2 PD-1/PD-L1 单抗 PD-1/PD-L1 通路一直是HCC免疫检查点阻断的主要靶点，PD-1是T细胞跨膜免疫调节分子，通过与其配体PD-L1 和PD-L2 相互作用，抑制T 细胞免疫应答，介导肿瘤的免疫逃逸，进而导致其发生、进展，其中PD-L1 的调控作用最 为 显 著［21］。抑 制PD-1/PD-L1 通 路 可 以 恢 复CD8+T 细胞的活化、增殖，增强抗肿瘤免疫应答［22］。现阶段PD-1 抑制剂Nivolumab、Pembrolizumab 等已被证实治疗HCC 有效［23］。一项Ⅰ/Ⅱ期非随机临床试验（NCT01658878）发现，在晚期HCC 患者中Nivolumab 剂量增加阶段，疾病控制率为55%，客观反应率为10%，MST为15个月；在剂量扩张阶段，接受Nivolumab治疗的200余例患者的6个月生存率为83%，9 个月生存率为74%。基于Nivolumab 在晚期HCC患者中安全可控，部分患者可出现早期、持续的应答。Nivolumab 于2017年9月23日获得FDA的快速批准，用于Sorafenib 治疗失败的HCC 患者［24］。Pembrolizumab 是一种针对PD-1检查点的重组单克隆人免疫球蛋白IgG4 抗体。一项非随机多中心开放标签的Ⅱ期临床试验共纳入104例Sorafenib 治疗失败的晚期HCC患者，研究结果表明Pembrolizumab对晚期HCC 患者的肿瘤缓解率为17%，疾病控制率超过60%，MST 为12.9 个月；患者12 个月无进展生存（PFS）率达到了28%，12 个月总生存（OS）率达到54%［25］。

3 HCC的血管正常化

血管生成是实体肿瘤的特征之一，涉及细胞外基质的降解，血管内皮细胞的活化、增殖和扩散，以及新血管网的建立，是HCC 发生与发展的关键过程［26］。与正常有序血管不同，肿瘤血管组织扭曲、囊状、混乱，血管壁结构异常，内皮细胞间隙大，周细胞脱落，基底膜厚薄异常，使得血管的渗透性增加，最终形成以组织间隙压升高、低氧和酸中毒为特征的TME，进而造成肿瘤对化疗和免疫治疗的抵抗［27］。HCC等实体肿瘤因缺氧的TME激活低氧诱导因子，进而激活下游效应分子VEGF［28］。VEGF 家族与肿瘤血管生成、新生血管维持、淋巴管生成、血管通透性等有关，也可通过下调淋巴细胞和T细胞功能，促进MDSCs、Tregs增殖等机制形成免疫抑制的肿瘤微环境，其高水平表达常与肿瘤的转移、侵袭、复发、低生存率相关［29］。抗血管生成治疗能够抑制肿瘤新生血管生成，提高周细胞覆盖，改善肿瘤血管灌注，降低血管活性因子的活性，从而减轻缺氧，最终增强肿瘤组织免疫细胞浸润，解除免疫抑制状态，提高机体免疫功能。抗血管生成治疗不仅抑制肿瘤血管生长，并且在治疗后能修复异常肿瘤血管系统，被称为“血管正常化”［7］。目前抗血管生成药物主要分为靶向VEGF/VEGFR 信号通路单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKIs）两种。

3.1 靶向VEGF/VEGFR 信号通路单克隆抗体 目前靶向VEGF 的单克隆抗体Bevacizumab 和靶向VEGFR 的单克隆抗体Ramucizumab 已被批准用于实体肿瘤的治疗［30］。Bevacizumab 通过与各种亚型VEGF相结合，阻断VEGF/VEGFR 信号传导通路，抑制VEGF 介导的肿瘤血管生成，抑制血管内皮细胞增殖和活化，从而发挥抗血管生成和抗肿瘤作用。单药Bevacizumab 治疗不可切除的HCC 的Ⅱ期临床试验结果显示，PFS时间为6.9个月（95%CI：6.5～9.1个月），1年OS率为53%［31］。Ramucirumab 是一种重组免疫球蛋白G，能够高亲和力特异性结合VEGFR-2 的胞外结构域，防止VEGF 配体结合和受体活化。一项随机Ⅲ期临床试验发现Ramucirumab作为一线Sorafenib 治疗晚期HCC 后续的二线治疗，对于基线高甲胎蛋白（甲胎蛋白＞400 μg/L）的患者，Ramucirumab 组与安慰剂组的OS 分别为7.8 个月和4.2 个月（P=0.005 9），提示基线甲胎蛋白水平高的HCC患者可能从Ramucirumab治疗中获益［32］。

3.2 TKIs TKIs 以肿瘤微环境中VEGFR 等促血管生成分子为靶点，通过抑制肿瘤细胞增殖和血管生成来诱导细胞凋亡［33］。TKIs 可有效治疗多种类型的肿瘤，Sorafenib 是首个用于HCC 治疗的TKI；2017年 后，Regorafenib 成 为 第 二 选 择。2018 年3 月Lenvatinib 作为一线TKI 治疗药物在日本上市，可用于HCC 一线、二线及三线治疗［34］。Sorafenib 通过阻断HCC 中VEGFR、血小板源性生长因子受体（PDGFR）和上皮生长因子受体（EGFR）通路，抑制血管新生和肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，显示出显著的抗癌特性；但仅有约30%的HCC 患者能从Sorafenib 治疗中获益，大多数患者在6 个月内迅速对Sorafenib 产生耐药性，导致HCC 的高复发率［35］。Regorafenib 是一种多激酶抑制剂，靶向VEGF、PDGFR、成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）和集落刺激因子受体（CSF-1R）。在随机化的Ⅲ期试验中证实使用Regorafenib可以改善在使用Sorafenib后出现疾病进展的患者的生存率，与Sorafenib 相比可显著延长患者OS（10.6个月和7.8个月，P＜0.05），其客观缓解率（ORR）为10.6%，最常见的3、4级药物相关不良反应为高血压病（15%）、手足皮肤反应（13%）、疲劳（9%）和腹泻（3%）［36］。Lenvatinib是一种治疗晚期HCC 的新型一线靶向抗癌药物，能够靶向VEGFR、FGFRs、PDGFR 等多激酶抑制剂，这使其在多种病理机制中显示出优越的抗肿瘤作用。2017年6 月美国临床肿瘤学会年会（ASCO）报道了Lenvatinib 一线治疗手术不可切除的HCC 的Ⅲ期临床研究（REFLECT 研究），结果显示Lenvatinib 组OS较Sorafenib 组有延长的趋势（13.6 个月和12.3 个月），Lenvatinib 组的次要临床终点也明显优于Sorafenib 组，包括PFS时间（7.4个月和3.7个月）、疾病进展时间（TTP，8.9 个月和3.7 个月）和ORR（24%和9%）［36］。

4 抗血管生成治疗联合免疫治疗

4.1 抗血管生成治疗与免疫治疗联合的作用机制 血管生成首先通过影响免疫细胞黏附和外渗，阻断免疫细胞渗透到肿瘤，其次对免疫调节细胞的功能产生系统影响，包括对Tregs、MDSCs 等免疫抑制细胞的诱导和增殖，抑制DCs成熟，抑制造血祖细胞的增殖［37］。VEGF 作为血管生成的关键驱动因子，还诱导毒素介导的CD8+T 细胞的衰竭。同时CD8+和CD4+T细胞通过分泌干扰素-γ（IFN-γ）抑制血管生成，诱导血管成熟［38］。抗血管生成治疗和免疫治疗之间的相互联系依赖于许多血管生成因子和免疫调节蛋白的双重功能信号，抗血管生成药物不仅能逆转VEGF 导致的免疫抑制效应，还可使肿瘤血管系统正常化，减轻Tregs和调节性B细胞的免疫抑制，也可增强T细胞介导的抗肿瘤免疫，进而增加对癌细胞的杀伤，杀死更具抗性的癌细胞［39-40］。免疫治疗诱导的CD4+/CD8+T 细胞比率升高可能会降低VEGF水平，从而降低肿瘤血管通透性，间接导致血管正常化［41］。根据抗血管生成治疗与免疫治疗相互作用的机制制定了新的联合策略，为提高HCC的疗效提供了机会。两者联合使用将通过创建正反馈环来提高临床疗效，重新调节肿瘤免疫微环境，以诱导持久的抗肿瘤免疫［42］。

4.2 抗血管生成治疗与免疫治疗联合的应用 Shigeta 等［13］证明抗PD-1/抗VEGFR-2 联合治疗在HCC 模型中可以克服抗血管生成治疗和免疫治疗的耐药性，联合治疗可以通过增加成熟血管的比例，增加T 细胞的浸润和活化，使TAMs 从免疫抑制的M2样状态转变为免疫支持的M1样状态来提高疗效。一项Ⅰb期随机队列研究（GO30140）显示，与单用PD-L1 单抗atezolizumab 治疗晚期HCC 患者相比，若联合Bevacizumab治疗可延长PFS时间。一项多中心Ⅲ期试验IMbrave150（NCT03434379）对这一组合进行了评估，晚期HCC 患者随机接受atezolizumab 和Bevacizumab 联合治疗与单独使用Sorafenib 治疗，联合用药的中位PFS时间为6.8个月（95%CI：5.7～8.3 个月），而Sorafenib 组为4.5 个月（95%CI：4.0～5.6 个月），差异有统计学意义［HR（95%CI）为0.59（0.47～0.76），P＜0.01］，ORR 分别为27% 和 12%（P＜0.01）；与 Sorafenib 相 比，atezolizumab 和Bevacizumab 联合治疗延缓了患者生存质量的恶化，是继Sorafenib和Lenvatinib之后首个能够一线提升晚期HCC患者生存状况的治疗方案，打破了晚期HCC 一线治疗的僵局［43］。Lenvatinib 联合Pembrolizumab治疗晚期HCC是一种新的、有效的治疗方案，这种联合用药的临床试验仍处于Ⅰb 阶段，预计疾病控制率（DCR）高达93.3%，中位PFS 时间为9.7 个月［44］。抗血管生成和免疫治疗联合治疗的不良事件因具体药物组合的不同而不同，高血压、腹泻、疲劳、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平升高是最常见的与治疗相关的不良事件［45］。

将抗血管生成和免疫治疗联合治疗成功地运用于临床还面临着挑战。未来要解决问题之一将是确定哪些HCC 患者可能从各种不同的组合中获益最大，并且需要可靠的生物标志物来对这些患者进行选择。如能鉴定出新型免疫检查点，为HCC的免疫治疗提供更多新的思路，会让更多的患者获益。应确定肿瘤“血管正常化时间窗”，并在此时间窗内有效地联合免疫治疗。大剂量抗血管生成药物也可能过度修复肿瘤血管，从而诱发免疫抑制的TME，所以确定药物的剂量尤为重要。此外，还需要确定每种组合的最佳顺序和时间，是同时用药还是序贯治疗［46］。

5 结论和展望

随着对HCC 进展的复杂性和肿瘤细胞对单药治疗产生耐药性机制的更深入地了解，血管正常化联合免疫治疗对提高疗效至关重要，将是HCC治疗最主要的趋势。后续研究应进一步了解血管正常化联合免疫治疗的分子和病理生理机制，建立和验证生物标志物，确定抗血管生成药物的剂量与联合治疗的疗效之间的直接关系、抗血管生成治疗介导的血管正常化与免疫治疗诱导的血管正常化之间的差异，延长HCC患者的生存期。