膜联蛋白A1对器官缺血再灌注损伤保护作用的研究进展

张元杰，张红

(1.遵义市第四人民医院麻醉科，贵州 遵义 563004；2.遵义医科大学附属医院麻醉科，贵州 遵义 563000)

缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是指组织或器官经过一段时间的缺血后重新恢复血供，但因组织器官生理功能未能及时恢复，而加重其功能障碍和结构损伤的一种病理状态。IRI的发生有两个阶段：由血管阻塞所致的缺血阶段和随后的再灌注阶段，表现为局部和全身的严重炎症反应[1]。临床常见于动脉搭桥、心脑肺复苏、溶栓疗法、断肢再植及器官移植等。“缺血”是指由于动脉流入受阻而导致的组织血液供应不足，组织细胞功能障碍的严重程度与受梗阻的程度和持续时间有关，对器官缺血的治疗主要为尽早恢复受影响器官的血流。然而，再灌注会产生大量的炎症介质，可以诱导和加重组织损伤[2]。近年来，寻找器官IRI的保护方法成为研究热点。目前，临床尚未发现IRI的特效药物和方法，原因主要为IRI机制尚不十分明确。膜联蛋白(annexin，Anx)A1是一种天然的内源性抗炎蛋白，可干扰粒细胞的聚集、迁移和在炎症部位的活性；参与调控炎症反应，细胞增殖、分化和细胞信号传递等过程[3]，从而减轻器官IRI。现就AnxA1对器官IRI保护作用的研究进展予以综述。

1 AnxA1

Anx是一类钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，其中AnxA1是最早发现的成员，也被称为脂皮素、依钙蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白或p35。AnxA1由中心结构域和N端结构域[4]组成。其在机体多数器官、组织中广泛存在，在中性粒细胞、上皮细胞、单核细胞中均高表达。Ac2-26是来自于AnxA1 N端结构域的活性肽，具有AnxA1的生物学功能。近年来研究表明，AnxA1参与多种细胞的病理生理过程，包括细胞信号转导、磷脂酶A2活性的抑制，以及宿主免疫系统中糖皮质激素抗炎反应的调节[5]。随着研究的深入，人们发现AnxA1对机体心脏、脑、肺脏、肾脏及胃肠损伤具有一定的保护作用。

2 AnxA1对器官IRI的保护作用及机制

2.1心脏IRI 缺血性心脏病是导致死亡的主要原因，心肌缺血时，由于氧化磷酸化停止导致的ATP消耗可抑制心肌收缩功能。最初，人们认为再灌注可以限制梗死面积并维持左心室收缩功能。然而，研究证明再灌注本身可以诱导心肌细胞死亡[6]。缺血性心脏病中的再灌注导致活性白细胞，尤其是中性粒细胞和其他介质，如补体碎片、活性氧类和促炎细胞因子在缺血组织中大量流出，而这些物质会促进心肌细胞死亡和心肌进一步损伤[7]，心肌细胞IRI后，胱天蛋白酶12和胱天蛋白酶3蛋白表达增加[8-9]，而缺血导致Ca2+超载，对心肌超微结构造成损伤。

在心肌IRI小鼠模型中，AnxA1模拟肽Ac2-26不仅可以减少心肌细胞死亡，而且还可以减轻心肌坏死、炎症、心肌纤维化和凋亡，对心肌起到潜在的保护作用[10]。其机制可能与Ac2-26减小心肌梗死面积和降低循环心肌细胞损伤标志物(肌钙蛋白)水平，延迟心肌梗死后的内皮细胞功能障碍有关[11]。Ac2-26在心肌IRI早期有心脏保护作用，可限制、延迟早期左心室收缩功能障碍，表明Ac2-26可能是心肌IRI的标志物，可能成为缺血性心脏病治疗的新靶点。Qin等[12]研究发现，内源性抗炎AnxA1在IRI后维持左心室活力和功能方面起重要作用，但其在体内的心脏保护作用机制目前尚不清楚。而Ac2-26可通过脂氧素A4/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路减轻心肌病理损伤和心肌超微结构损伤，减少脓毒症诱导的心肌细胞凋亡，对心脏有保护作用。其主要通过上调脂氧素A4蛋白表达水平，降低PI3K和Akt蛋白表达水平，下调核因子κB活性，降低肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，抑制h9c2细胞胱天蛋白酶3/8的活性来实现[13]。Perretti等[14]研究发现，AnxA1衍生肽CR-AnxA12～48在缺血再灌注诱导的心脏损伤中有显著的心肌保护作用。这种被称为CR-AnxA12～48的肽对促分解脂蛋白A4受体具有高度的亲和力和特异性，能促进凋亡中性粒细胞的有效增殖，减少中性粒细胞向活化的内皮细胞的募集，从而有效调节吞噬细胞反应。

2.2脑IRI 脑血管疾病是继缺血性心脏病后常见的死亡原因。急性缺血性脑卒中是引起脑血管疾病最常见的原因[15-16]，其治疗主要为快速再通闭塞血管，恢复血液供应，限制局部缺血损伤和全身缺氧损伤。然而，再灌注可导致分子水平和细胞水平的组织损伤，缺血可导致各种细胞介质的堆积，包括活化的白细胞(中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)和血小板的堆积，同时缺血可激活常驻细胞(小胶质细胞、星形细胞)和超氧化物的产生，进而刺激细胞因子[TNF-α和白细胞介素(interleukin，IL)-1β]的生成[17-18]。

Gussenhoven等[19]研究发现，在未成熟的脑组织中，AnxA1可预防脑缺血后血脑屏障丢失并改善缺血缺氧后血脑屏障的完整性，对脑IRI具有保护作用。在脑血管和脑室管膜诱导缺血缺氧后24 h内内源性AnxA1缺失，在小胶质细胞中缺血缺氧72 h后AnxA1上调。其作用机制主要为AnxA1通过靶向作用于甲酰肽受体(formyl peptide receptor，FPR)发挥治疗作用，而这一治疗作用可被FPR抑制剂所消除[20]。Peritore等[21]研究发现，在脑IRI过程中，AnxA1模拟肽Ac2-26很大程度上控制了炎症反应，对脑IRI有保护作用。有学者对小鼠双侧颈总动脉进行闭塞，然后再灌注，并用AnxA1模拟肽Ac2-26治疗40 min，结果发现小鼠白细胞黏附减少，2 h后所有脑微血管中白细胞-内皮细胞相互作用降低；而对照小鼠联合应用Ac2-26和FPR拮抗剂进行治疗，40 min时完全消除了Ac2-26的作用，且在应用FPR拮抗剂后2 h时效果较差，这可能因为Ac2-26对L-E早期作用更明显[22]。

Gimenes等[23]研究表明，Ac2-26通过下调炎症介质和神经元丢失发挥脑神经保护作用。炎症过程被认为是大脑颞叶癫痫病理生理学的一个重要机制，在毛果芸香碱诱导的大鼠癫痫持续状态实验模型中，Ac2-26的全身治疗降低了海马的神经元变性和白蛋白水平[23]。另外，Ac2-26降低了星形细胞标志物胶质纤维酸性蛋白的水平，并减少IL-1β、IL-6和生长调节α蛋白的表达。可见，抗炎蛋白AnxA1是通过抑制白细胞迁移和促炎介质释放来调节脑神经炎症的一个重要靶点。

Park等[24]研究发现，AnxA1通过抑制RhoA-ROCK信号通路恢复了β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)1～42诱导的血脑屏障破坏，对脑有保护作用。在小鼠脑内皮细胞系弯曲处，AnxA1可减少Aβ1～42引起的血脑屏障破坏[24]。而RhoA抑制剂减轻了Aβ1～42诱导的血脑屏障破坏，RhoA-GTP(RhoA的活性形式)持续过度表达减弱了AnxA1的保护作用。Vital等[25]采用活体显微镜观察发现，脑IRI伴有中性粒细胞、血小板活化，且中性粒细胞、血小板在脑微血管内聚集。而AnxA1 N端衍生肽Ac2-26可激活中性粒细胞，调节脑内中性粒细胞血小板聚集的形成，抑制脑微血管系统的反应，明显改善缺血后大脑微循环，对脑IRI有保护作用。

2.3肺IRI 体外循环肺损伤是心外科术后常见并发症之一，学者认为IRI可能是体外循环肺损伤的重要原因之一[26-27]，IRI可激活中性粒细胞，并在肺组织内聚集、潴留，产生炎症“级联瀑布”效应。而体外循环肺损伤的发生机制及寻找肺保护措施，一直是体外循环研究领域关注的热点。

Liao等[28]研究发现，在大鼠缺血再灌注诱导的肺损伤模型中外源性Ac2-26可显著减轻肺水肿、减少支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子的生成、减轻氧化应激、减少细胞凋亡及中性粒细胞溶解，减少受损肺组织中AnxA1蛋白的表达，抑制核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶途径，减轻缺血再灌注引起的肺损伤，对肺有保护作用。而用FPR拮抗剂Boc2处理可以消除Ac2-26的保护作用。在慢性阻塞性肺疾病诱导的动物模型中，腹腔内注射Ac2-26对慢性阻塞性肺疾病诱导的肺损伤有保护作用[29]。外源性Ac2-26可以防止支气管肺泡灌洗液、肺部和气管中的白细胞增多，其作用的具体机制为血浆和支气管肺泡灌洗液中的促炎介质减少，抗炎细胞因子水平升高。IRI后，肺组织、血浆中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高[30]。其中，IL-6被认为是严重急性肺损伤的标志[31]。

在AnxA1诱导的肺损伤模型中，肺成纤维细胞中的IL-6、IL-8和IL-1β水平在前6 h升高，后6 h下降。当AnxA1刺激的浓度升高和持续时间增加时，AnxA1足以缓解炎症，减轻炎症细胞因子诱导的胶原沉积，对肺有保护作用[32]。AnxA1可提高支气管上皮细胞的存活率，对肺损伤有保护作用。这种保护作用机制可能通过上调PI3K/Akt信号通路实现。同时，AnxA1通过减少活性氧类的产生，调节超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和乳酸脱氢酶的活性，可以减轻苯并芘诱导的氧化应激。

此外，AnxA1通过减少Bcl-2的表达，以及增加Bcl-2相关X蛋白和细胞周期蛋白D1的表达，减少细胞凋亡，从而起到肺保护作用[33]。肠IRI也是急性肺损伤发生的主要原因，而用外源性Ac2-26治疗可以减少肺血管渗漏，降低肠道IRI后肺组织中性粒细胞和髓过氧化物酶水平，这可能由于Ac2-26可以减少促炎细胞因子TNF-α的产生，并促进抗炎细胞因子IL-10的释放，从而起到肺保护作用[34]。

2.4肾IRI 肾移植是引起肾IRI的主要原因。由于先天性和适应性免疫反应的激活，移植肾在再灌注阶段会发生更严重的损伤，许多接受肾移植患者正在接受免疫抑制治疗，以预防移植功能障碍。环孢菌素是一种免疫抑制剂，用于避免器官移植排斥反应。环孢菌素治疗的主要副作用为肾毒性，其可降低肾血流量，增加肾血管阻力，从而使肾发生IRI[35]。

研究发现，Ac2-26外源性给药可以逆转肾毒性，对肾有保护作用[36]。肾IRI的特征为肾小球滤过率(即单位时间内两肾生成滤液的量)降低。缺血导致ATP的消耗，进而抑制肾小管Na+，K+-ATP酶的活性和Na+/H+交换器的再分布[36]。这两种情况均会导致管状细胞对Na+的再吸收减少。由于Na+滤过增加，Na+通过肾小管负反馈调节机制限制了肾小球滤过率，以避免Na+和水的流失[37]。肾IRI后肾功能受损，血肌酐、血尿素氮升高，肾脏小管上皮细胞脱落死亡[38]。Facio等[39]研究发现，在大鼠肾IRI模型中，给予外源性AnxA1模拟肽Ac2-26可减少肾小管坏死、吞噬细胞(包括中性粒细胞和单核细胞)的流入、Na+和K+排泄以及降低肾小球滤过率，从而对肾脏起保护作用。

糖尿病是一种代谢综合征，影响许多器官(包括肾脏)，30%～40%的糖尿病患者出现肾病[40]。Purvis等[41]研究发现，AnxA1可通过减少p38、胞外信号调节激酶和c-Jun氨基端激酶的磷酸化，激活Akt信号通路从而减轻糖尿病小鼠微血管并发症，对肾损伤有保护作用，这表明AnxA1可能是治疗肾功能不全的潜在策略。

2.5胃肠IRI 胃肠道系统的IRI主要见于腹部和胸部血管手术，也可能与小肠移植和出血性休克有关。大多数胃肠道并发症导致肠系膜缺血和IRI。其中，与肠系膜IRI相关的死亡率为40%～60%[42]。炎症是肠道IRI的重要因素。肠道IRI通过核因子κB激活局部炎症反应，诱导炎症细胞因子(如细胞因子、细胞间黏附分子)和趋化因子受体的产生。IRI导致白细胞的募集和渗透，造成组织损伤[43]。同时，缺血的肠黏膜也会产生大量不同的炎症细胞因子和趋化因子，如TNF-α、IL-12、IL-15和IL-23，它们可以显著增加白细胞浸润，加剧炎症和损伤[44]。

研究发现，在小鼠肠系膜IRI模型中，静脉注射Ac2-26可抑制白细胞黏附和迁移，对肠系膜IRI有保护作用[45]。上皮细胞屏障的丧失是肠IRI的主要特征，但目前关于AnxA1对肠IRI模型中上皮细胞屏障影响的研究较少。研究显示，AnxA1在胃肠道炎症小鼠模型(包括结肠炎和胃溃疡)中起保护作用[46]。另有研究表明，Ac2-26可促进胃黏膜损伤的愈合，减小溃疡面积，对胃有保护作用。Leoni等[47]研究发现，当使用聚合物纳米粒在肠道局部输送Ac2-26时，可以增强结肠炎的上皮细胞修复，对肠有保护作用。在活检诱导的肠IRI模型中，将外源性AnxA1模拟肽Ac2-26封装在靶向聚合物纳米粒(Ac2-26 Col Ⅳ NP)内，局部肠道输送加速了小鼠结肠损伤的愈合[47]。此外，Ac2-26 Col Ⅳ NP一次全身给药可加速实验性结肠炎后的恢复。

AnxA1在肠道切口愈合中依赖于FPR1/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，Nox1)的作用[48]，AnxA1与FPR1结合后，激活SRC和下游Nox1，由Nox1产生的活性氧类导致人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和ptp-pest的快速可逆性氧化，随后迅速失活。这种失活的磷酸酶参与细胞运动，并导致Fax和Paxillin的局灶性黏附蛋白活化，从而增加上皮细胞运动和切口修复，对肠道有保护作用[49]。在右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎模型中，学者发现AnxA1可以通过与FPR受体结合来调节肠道黏膜损伤和炎症反应，对肠道有保护作用。

3 小 结

近年来，寻找器官IRI的保护措施是研究的热点。AnxA1作为钙依赖的磷脂结合蛋白，目前已被证明对多种器官IRI有一定的保护作用。AnxA1可干扰粒细胞的聚集、迁移和在炎症部位的活性，通过减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，减少器官缺血后再灌注组织损伤，对器官起到保护作用，有广阔的应用前景。但AnxA1对器官IRI方面的保护作用机制有待深入研究和阐明。且目前对AnxA1的研究多停留于动物实验，在临床的推广使用需进一步验证。未来，期望AnxA1的药理学研究会有新进展，并将其应用于器官IRI的临床靶向治疗。