甲型流感病毒的进化及对流感防治的启示

祁 贤

0 引 言

正粘病毒科有甲乙丙丁四个流感病毒属，除了丁型，其他三个属都可感染人。据WHO估计，人季节性流感在全球每年都会引起5%～15%人群感染并致约50万人死亡[1]，由此引发严重的健康危害和公共卫生负担。甲型流感病毒可以感染多种动物，在自然界中有复杂的生态循环机制。人类甲型流感病毒都起源于禽流感病毒(avian influenza A virus, AIV)(有时会通过猪等哺乳动物作为中间过渡宿主)。病毒囊膜上有血凝素(haemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidae,NA)两种糖蛋白，根据其抗原性甲型流感病毒可以分为不同的血清型，目前在自然界里已经发现了18种HA亚型和11种NA亚型[2]。1918年西班牙大流行以来，在人群中流行的甲型流感病毒有H1N1、H2N2和H3N2亚型，其中H2N2亚型自1968年已经在人群中消失，H1N1和H3N2仍然是目前季节性流感的重要成员。

甲型流感病毒的基因组是分8个节段的单链负义RNA。基因组长约13.5 kb，编码11种病毒必需蛋白：表面蛋白HA、NA和M2；组成病毒核糖核蛋白体(vRNP)的PB2、PB1、PA和NP蛋白；基质蛋白M1；非结构蛋白1(NS1)和核输出蛋白NEP[3]。此外，有些病毒株还可以编码一些附属蛋白，诸如PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PB2-S1、M42、NS3等。核苷酸突变和基因重配是流感病毒进化的主要方式。与DNA聚合酶相比，流感病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)保真度较低且缺乏3′-5′核酸外切酶校对功能，核苷酸突变率高达2×10-6～2×10-4，而前者的突变率仅约为10-9，这也是所有RNA病毒容易发生变异的主要原因[4]。因此，流感病毒在复制过程中会产生大量的遗传突变体(称之为病毒突变体云或突变体群)，这种准种(Quasispecies)式的遗传特征对病毒进化产生深远影响，也给流感防治带来诸多挑战。

本文从甲型流感病毒在自然生态中的动态进化、病毒跨种传播的机制和季节性流感病毒宿主体内进化与传播等方面，概述影响病毒进化的诸多因素；据此对流感的监测预警、预防控制和药物疫苗开发等提出建议。

1 甲型流感病毒在自然生态中的动态进化

甲型流感病毒在自然界的进化较为复杂，涉及不同动物宿主、气候、地理环境等因素。生活在湿地和水环境的雁形目(如鸭类和大雁)和鸻形目(如海岸鸟和海鸥)水禽是甲型流感病毒H1-H16和N1-N9亚型的主要自然储存库[5-6]。H17N10和H18N11亚型主要在蝙蝠中循环，目前还没有证据表明能够感染其它物种[2]。甲型流感病毒以野生水禽为核心，在环境、宿主和病毒相互作用下，外溢感染其他物种(家禽、猪、马、犬、海豹、水貂等)并引起这些动物的发病或流行，由此构成了甲型流感病毒在自然状态下复杂的动态进化场景。

在长期的协同进化过程中，甲型流感病毒与野生水禽达到了较为稳定的感染平衡状态，水禽按季节有规律的迁徙行为和特殊的水环境栖息地，为病毒的在水禽中的稳定进化提供了理想的生态学条件。近30多年来，由于H5、H9等亚型病毒在东亚家禽中长期暴发流行，甲型流感病毒在野生水禽中稳定进化状态被打破。特别是2005年以来，H5N1/H5N6/H5N8高致病性流感病毒从家禽回传到候鸟，引起大量候鸟发病死亡，同时对候鸟中低致病性禽流感病毒的进化产生重要影响。可以预见，正在发生的一些自然因素的改变(主要是全球变暖和气候改变)和人类的活动(湿地和海洋开发、环境污染等)[7]，将对候鸟的栖息地造成灾难性破坏，也会极大的改变候鸟繁殖、觅食和迁徙等行为，由此造成对病毒进化和扩散的影响难以预料。

家禽和家养哺乳动物(猪、马、犬等)在甲型流感病毒从自然储存库感染人类的过程起着重要的桥梁作用[5]。东亚拥有世界上数量和密度最大的猪和家禽养殖。在中国除了工厂化集约化养殖外，传统的混养和散养模式仍然很普遍。家养动物常与迁徙中的候鸟共用水域，增大了与候鸟的直接或间接接触机会，为甲型流感病毒由候鸟传播给家养动物创造了条件。病毒在陆生家禽(鸡、火鸡、鹌鹑等)和猪体内不断积累宿主适应性突变，并频繁通过基因重配方式加速进化[8]。人类通过职业行为(养殖、屠宰、售卖等)和去活禽市场交易等方式，与携带病毒的动物或被污染的环境接触而增加感染机会。因此，陆生家禽和猪群中甲型流感病毒的动态进化，为未来产生引发人类流感大流行的变异毒株提供了可能。

2 甲型流感病毒跨种传播的适应性进化

动物源性流感病毒能够跨物种引起人类流感大流行，是病毒、动物宿主、个体与人群、自然环境和社会环境等综合因素作用的结果。病毒和宿主的生物学特性及相互作用是所有甲型流感病毒跨种传播影响因素的关键[9]。病毒获得在人群中引起大流行的能力，需要进化出两个基本条件：①感染人类个体并完成病毒复制；②能够在人际间以飞沫方式传播。

在特定的环境中(如养殖场、活禽市场等)，人类个体暴露于禽流感病毒，病毒能够机会性外溢感染人，病毒在人体内需要克服物种限制障碍完成病毒复制。在此过程中，病毒既需要人体分子的协助，同时也会遭遇一些人体分子的限制。病毒的高突变率为适应性进化提供了物质基础，这种适应性突变涉及病毒编码的每个蛋白，特别是参与病毒吸附、vRNP运输和入核、基因组复制和规避宿主天然免疫应答等过程的一些重要蛋白。

病毒HA蛋白与宿主细胞表面糖链的末端唾液酸(sialic acid,SA)受体吸附，是启动感染的第一步，也是重要的宿主限制屏障[3]。不同物种细胞表面的糖链种类和结构、糖单体连接方式和数量、糖链的修饰以及SA结构等都有差异。禽流感病毒主要结合α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)，人流感病毒对α2-6半乳糖苷唾液酸(SAα2-6Gal)有亲和力。人上呼吸道环境的PH偏酸性，上皮细胞含有丰富的SAα2-6Gal受体；下呼吸道环境偏中性，上皮细胞中SAα2-6Gal和SAα2-3Gal的含量都很丰富。NA蛋白的功能是水解SA，保证子代病毒出芽后释放，同时避免子代病毒聚集。不同物种上皮细胞糖链和SA的特性也推动了病毒复制过程中HA和NA的协同进化；此外，HA蛋白受体结合功能和NA蛋白SA水解功能间的平衡，对于病毒的稳定和空气传播有重要作用[10]。

病毒内化进入细胞后，在细胞分子协助下将vRNP释放到细胞质内。流感病毒在宿主的细胞核内完成基因组转录和复制，这一步也是重要宿主限制障碍。vRNP在细胞质内运输、进入细胞核完成基因组复制过程中，除了病毒编码的蛋白，许多宿主蛋白都参与其中，发挥协助或抑制功能。禽类和人的蛋白结构和功能有差异，提供给RNA聚合酶发挥最佳活性的细胞内环境温度也不同，这些限制性障碍使得禽流感病毒一般很难在人体细胞内完成有效的复制。目前研究的比较清楚的宿主蛋白包括MxA、RIG-I、KPNA6、HAX1、ANP32A/B和DDX17等。研究表明，三个多聚酶基因(PB2、PB1和PA)、NP和NEP的一些适应性突变，能够帮助病毒克服人体蛋白的限制作用，增强病毒RNA多聚酶在人体内的复制能力，特别是PB2蛋白的E627K突变对于禽流感病毒在人体内的适应有重要作用[9]。此外，不同宿主的天然免疫应答在组织构造和抗病毒机制方面都有差异，这也构成了对病毒跨种感染的一种屏障。禽流感病毒进入人体细胞后，会遭遇人体的天然免疫应答、细胞自噬与凋亡等反应。虽然病毒自身编码一些蛋白(如NS1和PB1-F2)有抑制机体天然免疫应答、细胞自噬和凋亡等反应的作用，但病毒仍需要进行适应性突变来寻求与人体细胞相互作用过程中达到新的平衡。

大多数感染人的动物流感病毒不能在人际间有效传播，病毒表现为一种感染终止或“死胡同似”感染[11]。禽流感病毒在感染患者的体内完成复制后，能否继续在人际间传播受许多因素影响，除了医学干预和环境因素外，主要还是与病毒的跨种适应性进化结果有关。禽流感病毒在人体内完成基因组复制的每个阶段都面临着人体的选择性瓶颈；随后产生的大量子代病毒群，在通过人呼吸道扩散时，面临着更大的人际间传播瓶颈。禽流感病毒的HA蛋白在人上呼吸道偏酸性(pH约为5.5)的环境中稳定性较差，病毒在穿越上呼吸道粘液时，大部分病毒丧失感染性。此外，HA蛋白在环境中的稳定性是禽流感病毒能够实现空气传播的一个重要条件。禽流感病毒感染人积累适应性突变的过程中，需要付出进化代价，产生的大量病毒是有害突变体，通过宿主和环境的选择性瓶颈后，大多数病毒被选择消除掉。

基因重配是流感病毒另一种重要进化方式，禽流感病毒通过与人或猪流感病毒重配，有可能克服进化中的穆勒棘轮效应(Müller′s ratchet)而获得快速适应人体的突变株[3]，猪和人都可能成为发生基因重配的“混合器”。过去100年来，人类4次流感大流行有3次(1957年H2N2、1968年H3N2和2009年pdmH1N1)都是人流感病毒与禽或猪流感经基因重配产生的变异株引发。因此，避免禽流感病毒和人与猪流感病毒的混合感染，对于防止出现适应人体的新型流感病毒有重要意义。

3 季节性流感病毒的宿主体内进化和传播模式

新的流感病毒引起的大流行过后，新病毒一般会作为季节性流感病毒，在人群中持续存在并引起周期性的流行。季节性流感病毒全球流行规律的研究显示，病毒在基因水平上的进化是连续的，但抗原水平上表现为不连续的“抗原团簇”进化模式[12]。此外，不同亚型病毒的全球流行模式也存在差异。H3N2病毒抗原进化速度快，平均每2-3年出现新的抗原变异株，每年全球流行的种子病毒都起源于东亚-东南亚和南亚地区[13,14]。相比之下，H1N1和B病毒的进化速度较H3N2慢，流行间期在全球多个地方零星散发存在，没有相对固定的种子发源地，每年全球的流行也呈现多点暴发的特点[15]。由于抗原进化速度快，H3N2流行时能够感染各个年龄人群；而H1N1和B病毒主要感染儿童，感染成人的机率比前者小。从全球来看，在温带地区，流感流行主要发生在冬季，在低温低湿环境下，呼吸道飞沫是主要传播方式[16]；而在热带地区，病毒全年都在循环，但流行主要发生在雨季，在高温高湿的条件下以直接接触或接触病毒污染物为主要传播方式[17]。

病毒在进化过程中产生免疫逃逸的抗原变异株，并能够在人群中传播，这是季节性流感周期性流行的主要原因。随之出现一个长期困扰人们的问题：变异株是如何产生和传播的？近年来，随着深度测序技术和信息分析技术等的进步，对于这个问题的解答有了一些重要进展[18]。季节性流感病毒的进化和传播链包括病毒在感染者体内进化、有限宿主之间传播、本地人群传播和全球流行等环节，其中涉及病毒特性、感染者的遗传学和免疫学状况、人群免疫状况、人类活动以及气候环境等众多因素。

在宿主体内进化是病毒产生有流行病学意义变异株的前提和基础。由于RNA病毒的高突变率，流感病毒感染个体后，在宿主体内增殖过程中产生大量的遗传突变体，这为病毒在人群乃至全球的快速进化提供了原料。不同遗传和免疫状态的个体为病毒的感染和复制提供了不同的场景，因而对病毒的体内进化有不同的影响。大多数流感是急性感染(一般感染过程为5～7 d)。在免疫空白(没有免疫接种和感染过病毒)宿主，病毒的体内进化主要受天然免疫应答调控，包括黏膜屏障、Toll样受体通路和干扰素激活等。个体初次感染7～10 d后产生抗体，对病毒体内进化的抗原选择压力较小。有些研究报道，在免疫功能正常的急性感染患者中，只观察到有限的病毒遗传多样性，疫苗接种和先前感染似乎不能提供免疫选择压力，对于体内出现抗原变异株的影响甚微[19-21]。原因之一可能是由于病毒在急性患者体内进化的时间有限。相比之下，免疫功能低下或缺陷患者，在流感病毒体内进化中的作用可能更受关注[22-23]。这些患者感染流感病毒可能会出现严重疾病并持续数周或数月，这就为病毒进化提供了较长的时间跨度和较弱的免疫选择压力，由此产生适应性突变株(抗原性突变或耐药性突变)的概率大为增加，情况类似HIV等慢性感染病毒的体内进化[24]。显然，流感病毒在宿主体内的进化受诸多因素影响，其进化机制的揭示需要未来大量深入的研究[25]。

病毒在个体宿主的体内进化产生的适应性突变株，理论上可能会成为未来人群中流行病毒的种子。但体内进化产生的大量突变株，是如何经过选择而固定为群体流行株的，其详细机制尚不清楚。体内进化产生的病毒群，在传播给其他个体过程中，会遭遇瓶颈效应的限制，病毒的数量和遗传多样性都会大量丢失，只有少数的突变体成功感染新宿主[26-27]。宿主间传播瓶颈的出现，可能来源于两方面压力：①人体呼吸道黏膜屏障中含有的大量游离唾液酸，与病毒结合使其失去感染力；②宿主的获得性免疫应答对病毒产生强烈的抗原性选择压力，特别是穿过上皮细胞进入人体上呼吸道的抗体(主要是IgA和少量IgG)。

突变病毒进一步在人群中传播时，也会遇到相似的传播瓶颈限制，病毒可能在瓶颈下消失，也可能突破瓶颈成为人群中流行的新病毒。人群中的传播瓶颈的大小，可能涉及群体免疫选择压力，以及新突变病毒与正在人群中流行的优势病毒的竞争等，但详细机制有待破解。

4 病毒进化对流感防治的启示

半个世纪以来，全球出现的新发传染病有30多种，大多数病原体属于病毒，如HIV、埃博拉病毒、SARSV、MERSV、pdmH1N1、SFTSV、寨卡病毒等[11]。这些病原在感染人之前，一般长期处在一种较为稳定的生态环境中，并在其中的动物储存宿主中循环。人类的活动增加了接触这些病毒的机会，病毒通过跨种外溢和积累适应性突变获得感染人的能力，有些通过染某些中间过度宿主，逐渐进化出在人群中引起流行乃至大流行的能力。2019年末人群中出现SARSV-2，很快在全球引起大流行，对人类社会的发展产生了深远影响，也促使人们重新思考传染病的本质和人与自然的关系。显然，对甲型流感的深入研究，将为动物源性传染病的防治提供重要参考和借鉴。

与冠状病毒相似，作为一种人和动物的重要病原，甲型流感在自然界的分布和进化也非常复杂。近年来由于工业化、城市化等人类活动的加剧，原有的生态环境被打破，甲型流感病毒在全球的循环模式也发生改变，未来进化的不可预测性在增加。为了更好的预防和控制甲型流感病毒引发的公共卫生风险，有必要从生态学角度重新思考和布局：①建立跨物种跨领域、完善的甲型流感病毒监测体系，包括野生水禽、海洋哺乳动物、家禽、家养哺乳动物(猪、马、犬和猫)等；②加强环境和鸟类保护，建立候鸟栖息地保护区；③反思畜禽养殖的发展对环境的压力，以及对新发人兽共患传染病的影响；④深入了解甲型流感病毒在不同物种中的进化特点；⑤从病毒和宿主及其相互作用等方面深入研究甲型流感病毒跨物种传播机制，特别是跨种感染人的分子机理，在此基础上进行流感大流行动态风险评估和制定相应的预防干预措施。

流感病毒在人体内以准种方式进化，对全球季节性流感的周期性流行有重要影响。这方面的研究对于当前流感的防治有重要指导意义，概括为：①利用深度测序和信息分析技术完善季节性流感监测体系，扩大监测范围，深入全面了解季节性流感的全球流行规律；②临床上将免疫低下的流感患者作为重点救治对象，并了解病毒的体内进化特点，做好防护和隔离，避免抗原突变株或耐药株的出现和传播；③利用基因组学和免疫组库测序等技术，精准筛选有效的疫苗侯选珠；④针对流感病毒频繁的抗原变异和人体免疫时产生的“抗原原罪”等现象[28-29]，利用新型疫苗设计策略(如mRNA疫苗和病毒活载体疫苗)开发流感通用疫苗；⑤利用流感病毒的高突变率特点，制定新的抗病毒策略，比如联合用药和致死性诱变剂等[4]。

综上所述，从个体、人群以及生态环境等多方面深入了解甲型流感病毒的进化特点和影响因素，对流感的监测预警、预防控制和药物疫苗开发等都有重要意义。