硫酸吲哚酚与血管钙化的关系的研究进展

何叶梅综述,欧三桃审校

0 引 言

血管钙化并非钙磷结晶在血管壁的被动沉积，而是经过多种分子信号传导途径启动和调节的主动过程，类似于骨的矿化，是慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)、衰老、动脉粥样硬化、糖尿病等疾病中的普遍病理现象，与增高的心血管疾病发病率和死亡率密切相关[1-2]。而CKD患者发生血管钙化的病理生理机制十分复杂，目前尚未完全明确。而近年来研究发现，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)可通过诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化、诱导细胞凋亡、自噬、破坏钙化平衡等机制参与血管钙化的发生，而降低血中IS水平，有望改善CKD患者并发心血管疾病不良事件的结局。因此，本文就IS与血管钙化的关系的研究进展作一综述。

1 IS概述

肠道菌群是人体重要的组成部分，在调节机体免疫和代谢方面发挥重要的作用，正常的肠道菌群可保护肾功能，清除体内毒素。而CKD患者由于存在饮食变化、高尿酸水平、磷结合剂等药物的使用等因素，易出现肠道菌群失调，从而导致尿毒症毒素的蓄积[3]。尿毒症毒素的积累被认为是CKD严重后果的关键因素，目前已发现的尿毒症毒素有 130 多种[4]，其中由肠道细菌的代谢产物生成的毒素称为肠源性尿毒症毒素，主要包括IS、吲哚-3乙酸、三甲胺-N-氧化物(TMAO)和对甲酚硫酸盐(PCS)等，IS是当前研究最多的肠源性尿毒症毒素之一[5]。研究表明，IS是食物中色氨酸被肠道菌群分解并经过肝代谢后生成的，90%以上的IS 与血浆白蛋白结合，然后通过有机阴离子转运蛋白 (organic anion transporter,OAT) OAT-1和OAT-3被肾小管细胞摄取, 由肾小管分泌，随尿液排出[6]。CKD患者随着肾功能进展，肾小球滤过率下降，IS排泄减少，从而在体内蓄积。有研究显示，在CKD2 期和3期即可出现循环IS水平的增加，CKD患者的游离型IS平均浓度可高达3. 22 mg/L[7]。IS 的毒性作用目前已得到广泛证实，有研究发现IS的血清水平与肾功能呈负相关，与主动脉钙化和心血管死亡率呈正相关[8]。IS可通过氧化应激、加速细胞衰老和激活炎症反应等机制参与肾损伤，并参与CKD患者肾性骨病、血管钙化、肾性贫血等并发症的发生发展。

2 血管钙化概述

血管钙化是钙、磷以羟基磷灰石的形式在血管壁发生异位沉积的病理现象，类似于骨的形成过程，是造成CKD患者心血管损害的一个关键环节[9]。临床上VC分为内膜钙化及中膜钙化。内膜钙化是内膜增生伴富含脂质的巨噬细胞浸润所致的一种动脉粥样硬化性病变。而中膜钙化主要表现为羟基磷灰石晶体钙在动脉中膜的弹力层连续线样沉积[10-11]。 中膜钙化在CKD患者中最常见，其患病率和严重程度与肾衰竭的进展平行。当CKD患者合并存在血管和(或)心脏瓣膜钙化时，其心血管疾病风险将被列为最高级别，这表明血管钙化危害巨大。VC发生机制复杂，VSMC表型转化、氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡、基质囊泡产生、钙化抑制因子减少等因素都可促使细胞外基质发生矿物质沉积，导致VC的发生。而研究发现肠道微生物群衍生的尿毒症毒素如IS等非传统因素在促进血管钙化的发生发展中有重要作用。

3 IS通过多种机制促进血管钙化

3.1 促进VSMC发生表型转化目前认为血管钙化的核心环节是VSMC向成骨样细胞转化[12]。当VSMC发生成骨型或软骨型分化时,其收缩型标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)表达降低,而骨相关因子runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)等成骨相关蛋白表达增加[13]。

有研究证实，IS可通过诱导人主动脉平滑肌细胞 (human aortic smooth muscle cell,HASMC)中NF-κB活性增加发挥促血管钙化作用，使用PI3K/Akt 通路的特异性抑制剂后可观察到NF-κB 的激活明显减弱，同时抑制了HASMC 的成骨转分化，这些结果表明 PI3K/Akt/NF-κB信号通路在IS诱导的成骨转分化的发病机制中起重要作用[14]。在IS处理的高血压大鼠模型中也发现相似的变化[15]，表明IS可直接诱导VSMC发生表型转化，从而促进血管钙化的发生。高磷也是促进VSMC转分化为成骨样细胞的重要因子，抑制PiT-1(磷转运蛋白)会同时阻断高磷诱导的VSMC表型转变和钙化作用。而IS可通过激活JNK途径，上调PiT-1表达促进VSMC钙化[16]。值得注意的是，IS联合高剂量的磷可显著增强促钙化作用[17]。这表明IS不仅可直接促进VSMC发生表型转化，也可通过增强VC强诱导剂(例如高磷)等机制诱导VSMC的表型转化，从而产生促血管钙化作用。

3.2诱导VSMC过早衰老和凋亡研究发现，IS处理的高血压大鼠可观察到主动脉钙化区域VSMC衰老标志物p53、细胞周期抑制剂p21以及A型核纤层蛋白前体(prelamin A)的表达上调，并伴有VSMC成骨细胞转化增强及主动脉钙化的发生[18]。此外，凋亡也与血管钙化发生密切，IS可通过干扰Notch信号传导通路，显著激活caspase3 / 7活性，并以剂量和时间依赖性增加TUNEL阳性细胞比例，促进成骨细胞分化和凋亡，最终促进血管钙化的发生[15]。

3.3促进细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)的释放EVs是细胞主动释放的纳米级膜囊泡[19]。在内皮细胞和VSMC之间发挥重要作用。在IS介导的人脐静脉内皮细胞损伤的体外模型中，由IS诱导产生的内皮微囊泡(endothelial microvesicles,EMV)可诱导内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)功能障碍，使EPC维持内皮稳态的功能降低[20]。此外，由IS诱导产生的EMV还可通过促进HASMC促钙化基因Runx2和BMP2表达，使VSMC中钙的累积水平逐渐升高以及改变VSMC中TWEAK(肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导物)，趋化因子CCL2、CCL5 ，TNF-α，IL-6等促炎基因水平变化，发挥其诱导血管钙化的作用[21]。最近有研究证实，IS刺激内皮细胞释放的EV可增强VSMC中PiT- 1的表达，并诱导AKT和ERK的磷酸化，促进VSMC的成骨转分化[22]。

3.4介导炎症反应及促进氧化应激炎症反应在血管钙化的发生发展中有重要作用[23-24]，在 Opdebeeck等人[25]的动物模型中，慢性肾病大鼠分别接受IS[150mg/(kg.d)]喂养4 d和7周，结果显示给药4 d的大鼠主动脉钙化发生前急性炎症反应和凝血信号通路已被激活，而给药7周的IS的大鼠显示明显的主动脉和外周动脉的钙化，证明炎症反应在血管钙化早期已经存在。在Ito等[26]人的实验中，内皮细胞特异性 AhR 敲除的小鼠持续皮下注入0.79 mmol/L的IS，2 周后再注射 TNF-α，可观察到IS显著增强TNF-α诱导的白细胞向血管壁的募集，从而参与CKD血管炎症的发生。此外，促炎性巨噬细胞在IS诱导的血管钙化进展中的作用突出[27]。最近的一项实验研究发现，巨噬细胞可通过SLCO2B1基因编码的大鼠有机阴离子转运肽加速对IS的摄取，随后IS诱导巨噬细胞中的配体Dll4的表达，并触发Notch信号传导，从而加速动脉粥样硬化形成[28]。

有学者发现经IS处理的HASMC中，NADPH氧化酶Nox4的mRNA表达明显增加，进而采用siRNA的方法抑制了Nox4后，由IS诱导的Runx2、ALP和骨桥蛋白mRNA表达下调，表明IS可通过上调NADPH氧化酶Nox4刺激活性氧生成，促进成骨细胞特异性蛋白的表达，进而导致血管钙化的发生[30]。此外，在IS处理的高血压大鼠主动脉钙化区域可见氧化应激标志物8-羟基-2'-脱氧鸟苷和丙二醛的表达增强。可见氧化应激也参与IS诱导的血管钙化的发生[15]。

3.5下调钙化抑制剂血管钙化是一个主动调节的过程，涉及血管壁和循环中的钙化激活剂和抑制剂之间的平衡[13]。钙化抑制剂主要包括骨保护素、基质Gla蛋白、OPN、胎球蛋白A、Klotho蛋白等，它们可以抑制VSMC发生钙化。

Klotho蛋白被视为预防CKD患者心血管并发症的保护因子[32]。有研究证实，分别用浓度为0、200、500和1000 μmol/L的IS培养HASMC，6d后可观察到IS浓度为500和1000 μmol/L组HASMC的Klotho表达显著降低，细胞发生显著的成骨表型转变。给切除5/6 肾的大鼠腹腔注射IS[100mg/(kg.48h)]持续24周后，其主动脉钙化也比未进行IS腹腔注射的大鼠更显著。并且氮杂脱氧胞苷(5-Aza2dc)可在一定程度上通过增加Klotho表达从而抑制血管钙化的发生[33-34]。此外，IS可通过激活活性氧 /NF-κB信号传导通路抑制HASMC中的基质Gla蛋白的表达，从而抑制血管钙化[35]。OPN可以防止异位钙沉积，是一种有效且可诱导的VC抑制剂。磷酸盐和IS共同培养下，人脐静脉内皮细胞分泌的白细胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)可抑制HASMC中OPN的表达并发挥促钙化作用[17]。这表明IS可通过下调多种钙化抑制剂促进血管钙化。

3.6其他途径目前发现多种miRNA与CKD血管钙化和动脉粥样硬化的血管损伤有关[34]。各项体内外及临床研究证实，IS可下调miR-126、miR-21-3p、miR-214水平，上调miR-210、miR-92a表达水平，从而参与内皮功能调节，增加心血管疾病患病率[35-36]。miR-29b为VSMC钙化的重要保护因子，IS通过下调HASMC中miR-29b的表达，激活Wnt /β-catenin信号，提高Runx2和OPN的蛋白表达水平，参与血管钙化的发生发展[37]。

自噬是参与CKD血管钙化的重要机制，有研究发现，IS可通过激活自噬引起SET7/9表达下降，从而使成骨特异性蛋白Runx2和OPN表达上调，发挥其诱导血管钙化的作用，且该作用可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤显著减弱[38]，因此认为自噬会加剧IS诱导的HASMC的血管钙化。但自噬在钙化中的作用尚有争议，今后需进一步的研究确定其在IS诱导的血管钙化中的作用。

4 结 语

当前的研究已发现IS可通过多种途径直接或间接参与VSMC成骨样转分化及血管钙化的发生发展，有望成为血管钙化的预测指标及防治新靶点。目前临床上针对IS的产生及清除的治疗策略非常有限。各种改良透析方式可增加IS的透析清除率，但仍需要大样本的临床数据验证其有效性[39-40]。今后仍需要进一步探索IS参与血管钙化的机制，进一步寻找拮抗其作用的新药及干预靶点。