单基因病植入前遗传学检测的研究进展

姚利兰综述，陈鹏宇审校

0 引 言

单基因病又称单基因遗传病或单基因缺陷，通常指因点突变、片段缺失/重复、移码突变、融合基因、动态突变等单个基因变异而导致的疾病。人类单基因疾病种类繁多，超过10000种，并且每年以约10～50种的速度不断增加[1]。同时，人群中约3%～5%的人患某种单基因病，面临妊娠、诊断、治疗等多重难题，给患儿本身、孕妇及其家庭带来沉重的身心压力及经济负担。近年来，单基因遗传病植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing for monogenic/ single gene defects，PGT-M)技术的蓬勃发展[2]，可有效阻断单基因病的垂直传递，通过加强遗传咨询和生殖管理，为人类辅助生殖及提高人口质量提供了新的选择和希望，日益成为单基因遗传病预防控制的重要手段。PGT-M的检测技术的发展促使植入前胚胎中可检测到的遗传缺陷数量及精度不断提高。同时，随着单基因病罹患率增加、人口结构和生育意识的变化，单基因病诊治需求呈现出快速增长的趋势。随之，引发了一系列PGT-M技术临床应用相关伦理问题的热议。因此，有必要对PGT-M的检测技术发展历程、应用范围和现状以及相关伦理问题等作一综述，以期为临床应用提供参考。

1 PGT-M的新定义

PGT-M于2017年国际辅助生殖技术监督委员会(ICMART)和世界卫生组织(WHO)最新命名规范提出。该命名规范以植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing , PGT)取代并涵盖了原来的植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)和植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening, PGS)，指对卵母细胞(极体)或胚胎(卵裂期或囊胚期)DNA的HLA基因分型和遗传异常进行的检测分析[3]，也就是所谓的“第三代试管婴儿”。同时，进一步将PGT细分为HLA分型的植入前遗传学检测(PGT-HLA)、非整倍体植入前遗传学检测(PGT for aneuploidies, PGT-A)、结构变异植入前遗传学检测(PGT for chromosomal structural rearrangements, PGT-SR)以及PGT-M[2-4]。其中，PGT-M被明确定义为针对单基因遗传病或单基因缺陷在体外受精胚胎植入之前对胚胎进行遗传学检测的方法[5]。其意义在于PGT-M可作为单基因遗传病的一级预防措施，识别、排除携带单基因异常的致病突变胚胎，选择正常胚胎进行移植，进而阻断单基因遗传病的垂直传递，避免相关缺陷儿的降生。

2 PGT-M技术的发展历程

1990年，Handyside等[6]首次报道了基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)手段进行Y染色体特异性重复区段标记检测以避免伴X-性连锁隐性遗传病的男胎出生，开创了PGT-M在人类辅助生殖领域中应用的先河。PGT-M经历了极体-卵裂球-囊胚期滋养外胚层细胞三个阶段[7-10]，从一代试管婴儿技术到第三代试管婴儿技术跨越了30年。为尽可能的避免胚胎损伤和影响胚胎后期发育，并建立较为准确的检测体系，一直以来PGT-M只能是针对单细胞水平进行的检测，我们面临的最大的挑战从早期采用技术中面临的DNA量不足的难题转向现在采用全基因组扩增技术(whole gene amplification, WGA)后的等位基因脱扣(allele dropout, ADO)等问题。一系列技术的发展与成熟使得PGT-M的诊断能力逐渐提高，解决ADO问题的能力成为了评估诊断准确性的关键。发展至今，PGT-M的检测方式主要分为直接检测和间接检测。直接检测法指利用一系列的技术对变异位点进行直接检测，主要包括PCR[11]、WGA技术[12]以及基于WGA进行的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)、比较基因组杂交或微阵列比较基因组杂交技术(comparative genomic hybridization, CGH and array comparative genomic hybridization, CGH-array)[13]、单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism array, SNP array)[14]、高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)等；而间接检测方法中最常见的就是单倍型连锁分析法[15]。目前包括单细胞全基因组测序技术在内的直接检测方法尚不能有效解决ADO的问题，而单倍型连锁分析作为一种可规避该问题的间接检测和分析方法被广泛应用于临床。

2.1PCRPCR技术是最早用于PGT-M的检测技术，通过定制引物，可针对DNA序列的特定变异进行检测[16]。但PCR受限于技术本身及单细胞样本，操作过程中极易发生DNA的丢失或污染，导致扩增失败或扩增效率较低。此外，自发的细胞裂解和无核片段或退化细胞的活检也是导致扩增效率降低的其他原因。因此，在早期对胚胎单细胞水平的检测局限在于无法获取足够量的DNA模板[17]。

2.2WGA因为PGT能用的胚胎细胞较少，WGA的出现成功解决了单细胞水平检测中DNA不足的难题[20]。近10年来，WGA技术取得了巨大的进步，主要包含3类技术。第一类是基于PCR发展而来的引物延伸预扩增法(primer extension preamplification, PEP)[18]和简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)[19]技术，二者是较早应用单细胞的扩增技术，均只能对特异位点扩增，且存在严重的扩增偏倚问题，扩增前后偏倚倍数分别为220倍和61倍左右，因极高的错误率使其在临床实际应用中被其他发展起来的技术取代。2001年，Lasken等[20]提出基于Φ29聚合酶和等温随机引物扩增的多重置换扩增技术，成为单细胞扩增的又一类新技术，与PEP和DOP-PCR比较，可将DNA模板扩增约106倍，扩增前后偏倚率显著下降，但扩增偏倚率依然较高(约50%)，单基因变异检测仍无法适用，后续主要用于拷贝数变异分析。第三类是近年来发展的一项新技术——多重退火环状循环扩增法[21]，与前面的技术相比，除使用随机引物外，还利用了新的共同序列和温度循环，极大降低了对模板量的要求，扩增较均匀，扩增前后偏倚倍数仅2倍左右，可满足对单个细胞的检测，并且该技术的基因组覆盖度达到了90%以上，已在多领域应用。总体而言，WGA技术虽然同PCR一样无法避免单细胞扩增导致的ADO、污染等问题。但与PCR技术相比，全基因组扩增技术是一种单细胞扩增困难的有效解决办法，显著降低了扩增偏倚率和ADO，同时使得DNA模板呈线性扩增，为全基因组大规模研究提供了保障。

2.3FISHFISH技术的原理是依赖带荧光色素的特异性DNA探针和染色体特异序列杂交，通过荧光显微镜观察，对单细胞水平多个靶标进行定位、定量分析DNA的表达状况。该技术是最早用于胚胎植入前染色体异常的检测技术，尤其在性别选择、非整倍体检测中应用较多[22]，但能检测的染色体数目较少，仅针对13、18、21、X和Y染色体，且杂交能力有限、信号易重叠、多次检测又会发生DNA降解，分辨率较低，现已逐渐被其他方法所取代[23]。

2.4CGH-arrayCGH技术的本质是消减杂交技术与FISH技术的结合，利用荧光染料分别对待测胚胎和正常样本进行荧光标记，并与正常细胞中期染色体进行共杂交，然后采用参照组与对照组的荧光强度比率来反映待测样本中DNA表达差异量，再借助于图像分析技术实现DNA序列拷贝数变异及变异定位的检测[24]。最重要的是该技术弥补了FISH技术的染色体检测覆盖不足的缺点。CGH-array技术，是CGH与基因芯片相结合的技术，较CGH技术的灵敏度、精确度、自动化程度更高，主要用于嵌合体、非平衡易位、微缺失、微重复等异常的检测，但仍无法检测DNA序列的变化、平衡重排(罗氏易位、相互易位、倒位)、UPD和三倍体等，准确性较低[14,21]。

2.5SNP arraySNP array技术也称芯片技术，其原理是将大量SNP位点固定在芯片上，然后再与样品杂交捕获、激光扫描，可通过全基因组水平的SNP单倍型连锁分析，检测所有染色体的数目或结构变异，区分正常及染色体平衡易位或倒位、UPD、三倍体等[24,25]。通常，SNP芯片含有大约30万个检测位点，与FISH技术相比，其位点数量显著增加，这些位点几乎覆盖了整个基因组所有已知的基因或染色体片段，理论上可获知染色体的全部情况，且分辨率高，可达1.5kb[26-28]。但该技术的缺点是技术要求高、重复性差、费用昂贵，无法检测单碱基变异。

2.6HTSHTS最早是从焦磷酸测序的原理上发展而来的。自10余年前HTS首次用于植入前遗传学检测以来，逐步实现了非整倍体、结构变异、碱基变异的检测，成为了PGT-M领域最有潜力的技术。随着二代测序技术(next generation sequencing, NGS)的不断成熟，NGS几乎是HTS技术代名词。尽管三代、四代测序技术已经出现，但仍面临许多挑战，现主要应用于科研平台，目前各大基因检测公司针对PGT-M领域的应用仍以二代测序技术为主要平台。但是，基于NGS的全基因组检测在PGT-M上的应用价格昂贵，操作繁琐且生物信息分析过程复杂，使其无法作为一种常规的临床应用的检测方式[19,29]。此外，NGS与其他技术直接对单个胚胎细胞进行检测均面临样本量的不足、DNA模板量极低的客观现实[30]。尽管WGA技术的产生为后续大规模的研究提供了保障，但由于起始模板量极低(单个细胞DNA含量仅6～10pg)，模板成倍扩增随之产生ADO的问题，是当前直接检测面临的主要挑战[12,31]。因此，直接对胚胎突变位点进行检测的结果将变得不可靠，易造成误诊。

2.7单倍型分析技术单倍型分析技术通过短串联重复序列或SNP单倍型连锁分析，在疾病基因定位识别、探索顺式互作在基因表达调控中的作用、种群历史分析、进化遗传学研究等方面发挥着重要作用。2006年，Renwick等[32]率先提出“植入前单倍型分析”概念。植入前单倍型分析是指在体外受精-胚胎移植之前，基于单倍型连锁分析，利用一系列检测手段对胚胎的遗传标记进行检测，推断亲本间同源染色体不同遗传位点的组合，判断变异来源，对突变基因进行定位分析。这种基于疾病相关基因内部和附近的多个遗传标记的检测方式，借助特定位点的靶标检测，设计不同的试剂盒以涵盖更多的变异，进而可实现整条染色体的疾病定位及病因分析，可间接规避特定位点的高ADO问题，将正常染色体与突变基因所在的染色体区分开来，展示了其极高的准确性和可靠性[33-35]。因此，目前市面上基于NGS的单倍型分析技术被广泛应用于临床作为单基因病胚胎植入前遗传学检测的解决方案，针对特定疾病进行精细化设计及检测，大幅降低了检测成本，具有高灵敏度、高准确性、高检出率，适用范围广等优点。但在一些特殊情况下单倍型分析法也面临着严峻的挑战，如利用家系推断法推断单倍型时在家系成员缺失或难以获取时将无法实现[36]；其次，受连锁不平衡的影响，借助群体数据库的群体推断法往往会遗漏群体中极低突变率的个体，最终导致漏诊[35]；此外，对于一些新发变异，这里指父母无突变而子代存在突变的情形，单倍型分析法也易出现漏诊[36-38]。因此，一种既能直接获得单倍型(只需检测夫妻双方样本及胚胎样本)又能兼顾成本的方法将是今后发展的方向。

3 PGT-M的应用范围

单基因病遵循孟德尔遗传规律，从亲代向子代传递，故PGT-M的常规适应证取决于潜在的遗传变异背景。PGT-M通过一系列技术及分析方法可诊断胚胎是否携带异常单基因突变，并获知其变异的亲本来源。PGT-M的应用范围主要包括：①父母均携带已知基因的常染色体隐性遗传病，如囊性纤维化、地中海贫血、镰状细胞病等；②父母一方或双方常染色体显性遗传病，如脊髓小脑共济失调症、亨廷顿氏舞蹈病等；③X性连锁疾病，如血友病等；④父母具有不完全外显率的突变，如可导致癌症易发综合征的BRCA1/2突变；⑤父母携带某些染色体平衡易位或倒置；⑥HLA分型，寻找相同HLA配型进行干细胞治疗；⑦不明原因复发性流产，旨在减少反复流产引起的并发症和副作用[238-40]。随PGT检测能力的不断提高，越来越多的单基因病被纳入其中。值得注意的是，PGT-M作为国家、社会、家庭控制生育质量、实现优生优育而采取的积极的辅助生殖措施，虽然已在世界各地广泛应用，但大多数国家将PGT-M的适应证仅限制于严重性单基因遗传病[6-7]。而不对其他类型单基因疾病进行检测，如在下述情况下却不适用：①父母尚未确定是否存在明确遗传疾病；②性别选择，如平衡男女比例；③表型选择，如头发颜色、重睑等。这种应用性受到限制的原因在于PGT-M打破了传统自然妊娠的模式，面临诸多伦理、社会、法律等问题[39]。

4 PGT-M相关伦理思考

除技术、法律、经济等因素外，伦理问题是决定PGT-M未来发展的一个关键因素[41]。PGT-M在伦理上是有争议的，因为对受试者、胚胎和子代有潜在的影响。国际上关于PGT-M的本身争论主要集中在是否应该允许这样的技术，其对胚胎进行筛选的行为改变了人性，必然会威胁到人类尊严和自由民主权，并且将越来越多地导致市场驱动的不平等[42]。尽管PGT-M是针对胚胎植入前进行的干预措施，不违反“不伤害”原则，但为保证健康胎儿无差错的出生，实际应用中仍需牵涉体外授精、基因检测、植入后/产前检测三个领域，而每个领域都引发了各自的伦理问题[43]。围绕PGT-M相关胚胎的道德和法律地位及其潜在的优生维度的核心伦理问题，进而引发胚胎是否是一个完整生命，能否享有尊重、不伤害、生命自主权等基本权益以及最新关于人类基因库的潜在弱化、人伦关系、子代安全责任问题和社会上越来越多的不孕症等争论[44]。同时，PGT-M尚存在一定的误诊、漏诊风险，若错误淘汰了正常胚胎，剥夺了其生命自主权；若在产前检测中发现其漏诊，产妇不得已引产，又将违反了不伤害和尊重原则。此外，一些反对PGT-M的论点甚至是反对任何形式的技术干预生育的“自然选择过程”，进而衍生了“定制胎儿”这一消极看法，认为PGT-M可能导致“无意义的选择”，被滥用于特定表型筛选和性别选择等。实际上PGT-M的本质是一种寻求确保孩子出生时无明显不良的单基因遗传疾病方法，强调了非强制性和赋权性，以胚胎的生物学定位、滥用的可能性、子代远期安全责任问题等并不能作为PGT-M被禁止的充分理由，不应妨碍在当前采取行动预防子代不必要的疾病和身心痛苦[41]。鉴于科学、文化和宗教的不同，对PGT-M的态度在全球各个国家各个地区存在较大差异。PGT-M是否应该被接受用于哪些单基因疾病或新的医疗/非医疗用途，应取决于针对各国政策、宗教、信仰等仔细评估拟定的共识和对受试者的重要性及其可能造成的有害影响[41]。当前PGT-M尚处于发展中，存在技术和应用上的局限性，因此如何擅用各种PGT-M检测技术降低漏诊、误诊风险，加速辅助生殖医学伦理建设及完善，并在实际应用中结合各个国家的政策及专家指南/共识显得尤为重要。

5 国内PGT-M发展现状

2000年，“中华试管婴儿之父”庄广伦教授带领团队率先在中山大学附属第一医院行胚胎筛选、阻断了血友病携带者夫妇的致病基因向子代传递，完成了国内首例PGT-M，意味着中国自此之后进入了第三代试管婴儿的发展进程中。继之，北京大学乔杰院士团队、中信湘雅生殖与遗传专科医院、上海国际和平妇幼保健院、南京妇幼保健院等陆续通过植入前遗传学检测技术成功实现了家族遗传性多发性骨软骨瘤病、家族性罕见病视网膜母细胞瘤、Leri-Weill软骨发育不良症、MAGEL2基因相关变异、先天性骨骼发育不良等疾病的阻断[45-46]。单基因病并不罕见，作为人口基数大国，中国约有2000万单基因病患者[45]，而相较欧美国家，我国PGT-M发展仍较缓慢，尚能解决的单基因病范围有限，但其需求却呈现爆发式增长。截至2020年12月31日，国家卫生健康委员会官网(http://www.nhc.gov.cn)统计数据显示国内体外受精治疗周期数为1082192个，获批开展人类辅助生殖技术的医疗机构共536家，其中仅78家可开展胚胎植入前遗传学诊断技术。伴随分子测序技术的不断发展与成熟，将全面加速中国PGT-M的市场进程，现有的PGT-M技术和检测机构远无法满足市场需求，尚有广袤的发展前景。如今我国已经将PGT-M归为人类辅助生殖技术进行管理，并颁布了《人类辅助生殖技术管理办法》、《人类辅助生殖技术应用规划指导原则(2021版)》、《人类辅助生殖技术和人类精子库伦理原则》、《人类辅助生殖技术管理专项整治行动方案》等；同时，2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》发布[39]，均促进了整个市场进入规范化、专业化时代。未来，PGT-M技术将为中国更多的单基因病携带者的优生优育带来曙光，对我国“全面开放三孩政策”的实施执行以及单基因病出生缺陷儿发生率的降低做出进一步的贡献。

6 结语与展望

随着单基因病种类及患病率的不断增加，PGT-M作为单基因病一级预防措施及辅助生殖的重要手段，无疑是人类遗传学和临床领域关注的焦点。体外受精的胚胎在不同时期发育潜能、诊断能力有所差异，近年来在获取更高质量的胚胎单细胞数据方面取得了重大进展，胚胎细胞分离技术的提升，基因组扩增、测序和分析方法的改进以及PGT-M市场的规范化，无疑使PGT-M的应用更具前景。诸如单倍型分析技术，作为一种新型的检测技术间接规避了ADO的影响，为PGT-M在越来越多的遗传缺陷疾病中的应用开辟了道路，继之可检测的病种数量和应用范围也在逐年增加和扩大。因此，如何优化检测技术，克服ADO、降低成本，同时为临床应用提供合理的技术指导，将成为我们今后进一步探索的方向。同时，我们相信随着测序技术地不断完善与成熟，当前PGT-M面临的难点将会逐一攻破，低成本、高精准测序将不再遥远。