费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤体细胞突变的研究现状

吴 双，王春森

（1.川北医学院，四川 南充 637000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072）

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）的概念最早由美国血液学家William 于1951年提出，它通常表现为外周血中终末髓样细胞系的异常增殖。费城染色体阴性的骨髓增殖性肿瘤主要包括真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocytosis，ET）和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）。PV的特点是红系祖细胞和成熟红细胞的过度产生，ET以巨核系增生为特征，PMF 是一种比PV 和ET 更具侵袭性的疾病，以骨髓纤维化和巨核系扩增为主要特征[1]。MPN 的其他种类还包括慢性髓系白血病、慢性中性粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症、非特指型慢性嗜酸性粒细胞白血病和不能分类的MPN。MPN 被认为是罕见疾病，但其发病率正在增加。目前认为，MPN 的发病主要是由多能造血祖细胞的体细胞突变所致。MPN 也有家族性聚集的报道，这些家族中发现的异常包括JAK2、MPL、CBL、TET2、CALR 或RBBP6 基因突变，多为体细胞突变，但偶尔也有生殖系细胞突变[2-4]。本文主要综述MPN 体细胞基因突变致病可能的机制、突变在不同类型中的频率及预后相关性的研究现状，旨在加强临床对患者突变基因的认识。

1 表型驱动突变

MPN 的表型驱动突变包括JAK2、钙网蛋白基因（calreticulin gene，CALR）和血小板生成素受体基因（thrombopoietin receptor gene，MPL）的突变。8%～10%的PMF 患者和10%～15%的ET 患者没有常规的JAK2、CALR 和MPL 突变，即“三阴性”MPN，具有不良的临床结局[5]。

1.1 JAK2 突变 在MPN 中，JAK2 突变主要分为JAK2V617F 突变及JAK2 外显子12 突变。两种类型的JAK2 突变其均与MPN 的发生、发展相关。

1.1.1 JAK2V617F 突变 JAK2 基因14 号外显子突变造成JH2 假激酶结构域（Janus Homology 2，JH2）617位点上保守的缬氨酸被较大的苯丙氨酸所取代[6]，通过构象的变化导致JH2 正常的自抑制功能丧失，使其在没有造血生长因子的条件下与受体结合，进而导致JAK-STAT、涉及EPO 受体信号传导的其他通路以及调节细胞凋亡的磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositide-3 kinase，PI3K）通路不依赖细胞因子而激活，从而导致造血细胞的过度增殖[7]，它们在髓系细胞过度增殖和分化中起着重要作用。①JAK2V617F 突变增加细胞DNA 损伤：JAK2V617F突变在大多数MPN 患者中是一种早期体细胞事件，其突变可能增加细胞DNA 损伤，Zhao R 等[8]研究表明，JAK2V617F 突变与DNA 损伤增加有关，后有研究进一步证实了这个观点，指出JAK2V617F 突变通过细胞周期S 内检查点响应的疾病限制性损害促进复制分叉停滞，其表达与DNA 损伤增加有关[9]。同时，研究还提示JAK2V617F 的表达导致被γH2Ax 标记的双链断裂、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因位点突变和自发同源重组事件的频率增加[9]。②JAK2V617F 突变介导MPN 的免疫逃逸：致癌JAK2V617F 活性增强了突变细胞中程序性死亡受体配体1（Programmed cell death-ligand 1，PD-L1）启动子的活性和PD-L1 蛋白的表达，而阻断JAK2V617F活性降低了髓样突变细胞中PD-L1 的表达[10]。JAK2V617F 突变主要在单核细胞、巨核细胞和血小板中，通过减少T 细胞激活、代谢活动和细胞周期进程，进而导致PD-L1 介导的免疫逃逸[10]。另外，JAK2V617F 突变在吸烟者中更普遍，并且由于慢性炎症刺激，吸烟被认为是MPN 发生和其它相关髓样肿瘤的风险因素[11]。③JAK2V617F 突变预后：JAK2V617F 等位基因负荷在PV 中变化很大，50%以上的JAK2V617F 等位基因负荷被发现是进展为骨髓纤维化的危险因素[5]。JAK2 突变与年龄较大、血红蛋白水平较高、白细胞增多、血小板计数较低相关联[12]，此类患者的血栓风险较其他突变患者增高[13，14]。

1.1.2 JAK2 基因12 号外显子突变 JAK2 基因12 号外显子突变与JAK2V617F 类似，也会导致生长因子的高敏感性以及红细胞生成信号转导通路的持续性激活[15]。与JAK2V617F 突变相比，JAK2 外显子12突变的患者在更年轻时即表现出更明显的红细胞增多症[16]，这表明其促进了红细胞增多的表型，这些差异可能反映了通过促红细胞生成素受体的异常信号强度的差异。

JAK2 突变主要是激活JAK-STAT 信号通路在疾病发生中起作用，目前该突变已纳入国际预后评分系统。JAK2V617F 突变较JAK2 基因12 号外显子突变频率要高得多，而后者突变患者病例数较少，所以目前JAK2V617F 突变的研究更多，而JAK2 基因12 号外显子突变目前相关研究较少，未来需要更多对JAK2 基因12 号外显子突变相关的研究。

1.2 CALR 突变 CALR 基因编码的钙网蛋白是一种Ca2+结合蛋白，CALR 蛋白主要位于内质网内，除了参与内质网内的生物事件外，还参与内质网以外的各种生物事件。野生型CALR 在巨核细胞、红细胞分化和造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的自我更新中都有发挥作用[17]。

1.2.1 CALR 突变类型 目前已经在MPN 中发现了50 个CALR 突变体，所有的突变体都是+2/-1 碱基对移码，导致外显子9 的阅读框架发生+1 移码，从而产生所有突变CALR 蛋白共有的新的末端氨基酸序列。最常见的两种形式为[6]：①L367fs*46，一个52bp 的缺失（CALRDEL）；②K385fs*47，一个5bp 的插入（CALRINS）。类型1 相似突变在PMF 中更常见，类型2 相似突变在ET 中更常见[6]，而其他CALR突变类型较少见。

1.2.2 CALR 突变与MPN 目前CALR 反复突变诱发疾病的具体机制尚未明确，有研究提出CALR 突变诱导肿瘤发生的生物学要求：①MPL 及其N-糖基化位点的表达：突变的CALR 在高尔基体中的积累，其进入分泌途径并与N-聚糖相互作用的能力是其致癌所必须的，这是通过MPL 的组成性激活来实现的[18]；②突变体CALR 的突变型特异性C 末端，特别是它的正静电电荷[19]；③突变体CALR 和MPL 之间的相互作用：突变的CALR 主要通过MPL JAKSTAT 信号轴的组成性激活实现致癌转化，突变CALR 与MPL 相互作用，导致MPL 组成性激活，并激活JAK/STAT 通路的下游信号分子，从而驱动增强的巨核细胞生成和前血小板形成[20]；④突变体CALR 的凝集素依赖性功能：突变的CALR 与MPL的结合是其导致MPN 所必需的，但只结合是不够的，突变体CALR 的凝集素依赖性功能是与MPL 结合和细胞因子独立生长所必需的[21]。

Cimen BC 等[22]研究表明，CALR 基因的突变驱动MPN 的转化，引发T 细胞反应，可以通过免疫检查点阻断增强MPN 中共享新抗原诱导的针对突变CALR 的T 细胞免疫，这表明免疫疗法可以用于清除MPN 中携带CALR 突变的恶性细胞。

1.2.3 CALR 突变的预后 目前已在约70%的ET 或PMF 患者中发现了CALR 突变，而仅有极少数PV患者携带这种突变，PV 患者中CALR 突变的意义目前尚不清楚[6]。与JAK2/MPL 突变型MPN 相比，CALR 突变型患者往往较年轻，贫血和白细胞增多的发生率较低，血小板计数较高[12，23]。CALR 突变患者的临床预后比JAK2/MPL 突变患者较好。与JAK2/MPL 突变患者相比，CALR 突变患者血栓形成、贫血、血小板增多和脾肿大的风险更低，总生存期更长[13，24]。

CALR 突变体种类较多，还有待进一步发现更多的突变体，目前最频繁的突变是CALRDEL（1 型）和CALRINS（2 型），其突变导致了JAK/STAT 信号通路激活。CALR 突变患者预后较JAK2/MPL 突变患者更良好，且CALR 突变1 型患者预后比2 型患者更加良好，未来可进一步对CALR 突变各个亚型进行更多的研究。

1.3 MPL 基因突变 人血小板生成素受体/骨髓增殖性白血病（MPL）蛋白的单跨膜结构域由MPL 基因第10 号外显子编码，其突变可产生组成活性受体，从而失去对血小板生成素的依赖，进而促进疾病的发生发展[25]。

1.3.1 MPL 突变类型 MPL 突变最常见的是位于MPL 跨膜和胞浆结构域交界处的色氨酸W515 上的突变，最突出的突变是MPLW515L 和MPLW515K，但也有其他突变，如W515R，W515A 和W515G[26]。W515 位于MPL 的跨膜区，可以阻止MPL 的自发激活，W515 上的大多数突变导致在没有血小板生成素的情况下激活MPL，并导致JAK2 和STAT 蛋白信号的结构性激活和细胞因子的自主性生长[16]。另一种罕见的胚系突变，MPLS505N 位于跨膜区，以活跃的二聚体方式稳定受体[6]，最初这种突变被描述为遗传性血小板增多症的种系突变。

1.3.2 MPL 突变与MPN MPL 主要在HSC 和巨核细胞系中表达，MPL 基因单独突变就足以在人和小鼠中产生MPN。在PMF 患者中，MPL 基因的突变也能激活JAK/STAT 信号通路，而MPLW515L/W515K 突变更倾向于影响巨核细胞，JAK2 突变则更倾向于影响红系细胞[6]。事实上，除W515C 和W515P 外，W515 的所有替换都导致MPL 在没有血小板生成素的情况下被激活。这些MPL 突变改变了血小板生成素受体二聚体的几何结构，从而导致预先结合的JAK2 蛋白转磷酸化，导致结构性激活的JAK2/STAT信号通过血小板生成素受体启动[27]。

1.3.3 预后 研究发现，MPL 突变、JAK2 突变以及JAK2/MPL 突变的患者间的总生存期或无白血病生存期无统计学差异[28]。McNamara CJ 等[29]的研究发现，按突变状态分层的JAK2 与MPL 突变患者2 年生存率无差异。

1.4 表型驱动突变预后比较 Rumi E 等[5]的研究发现，CALR 突变患者的中位生存期为17.7 年，JAK2突变患者为9.2 年，MPL 突变患者为9.1 年，三阴性患者为3.2 年，与CALR 突变或JAK2 突变患者相比，三阴性PMF 患者白血病转化的发生率要高得多。由此可见，“三阴性”MPN 的预后是最差的。目前国内外对驱动基因突变预后的研究结果大多类似，未来可以开展更多对驱动基因亚型的研究，以明确各个亚型的预后，但很多亚型病例数极少，研究也相当困难，未来可以开展大样本、多中心、长时间的研究进一步深度探讨其各个亚型的临床意义。

2 除表型驱动突变外的特异性突变

MPN 基因突变分为特异性突变和非特异性突变。特异性突变除以上表型驱动突变外，还包括LNK2 号外显子突变，又称Src 同源2B3（Src homology2B3，SH2B3）突变[6]。LNK（SH2B3）基因编码是一种调节JAK2 激活的适配器蛋白[30]，所有LNK 蛋白家族成员都含有三个功能结构域：二聚化结构域和位于氨基末端的富含脯氨酸的基序，紧随其后的是Pleckstrin 同源结构域（PH）和Src 同源2 结构域（SH2）。大多数已鉴定的LNK 突变是针对所有外显子的错义突变，以外显子2 编码的PH 结构域为主[30]。LNK 非磷酸化的SH2 结构域和JAK2 磷酸化的JH2 结构域结合，从而抑制JAK2 的激活。LNK 突变已经在克隆试验和小鼠中被证明能促进JAK2V617F 细胞的生长[31]，该突变存在于0～9%的MPN 患者和11%的MPN 后急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）患者中[7]，而携带该突变的ET 患者总存活率较低[32]。

3 非特异性突变

3.1 表观遗传调控基因 参与表观遗传调控的基因包括DNMT3A、TET2、ASXL1、EZH2、IDH1/2 等，其中ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2 突变已被证明是不利的预后因素，这些遗传损伤独立于传统的预后评分系统，此类患者存在过早死亡或白血病转化的风险[5]。DNMT3A 突变在PV 和ET 中很少见，但在原发性和继发性骨髓纤维化（15%）或AML（20%）患者中更常见[33]。JAK2V617F 驱动的MPN 和DNMT3A 基因缺失之间的致癌有协作性[6]，JAK2V617F 表达和DNMT3A 缺失之间的突变合作推动了从早期PV 到晚期骨髓纤维化的进展。DNMT3A 还失活特定的染色质位点，如增强子元件，这些元件控制细胞类型特异性基因表达程序的建立，并在发育和癌症中起关键作用[33]。DNMT3 蛋白家族参与胞嘧啶（5mC）的甲基化，而TET 蛋白家族通过5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的活性去甲基化，这一过程被认为对干细胞基因调控特别重要[34]。所有TET2 突变都是功能丧失的突变，导致催化功能受损，5hmC水平降低，导致DNA 超甲基化[34]。虽然既往有些研究提示TET2 突变增加了白血病转化风险，但最近的研究并没有发现两者间的联系[32,35]。ASXL1 突变与不良预后和较高的白血病转化率相关。在小鼠模型中，ASXL1 的缺失导致进行性多系细胞减少和异型增生。在PMF 中，ASXL1 的缺失与更严重的贫血和患者存活率较低有关[24]。研究显示[5]，携带野生型CALR 和ASXL1 突变的PMF 患者的中位生存期为2.3 年，而携带CALR 突变和野生型ASXL1 的PMF患者的中位生存期为10.4 年。Yang H 等[36]的研究表明，ASXL1 截断突变通过与溴域和末端外域溴域蛋白4 的相互作用而发挥功能增强效应，这一发现为制定针对髓系恶性肿瘤ASXL1 突变的治疗方法提供了参考。

EZH2 功能丧失突变与JAK2V617F 突变相关，促进骨髓纤维化发展和预后不良[5，7]。Yang Y 等[37]研究提示，EZH2 的缺失和JAK2V617F 通过增加JAK2V617F 干细胞的适合度在疾病启动方面具有很强的协同作用。在细胞水平上，EZH2 的缺失与JAK2V617F 一起抑制红细胞生成和促进巨核细胞的生成，从而加速骨髓纤维化进展[37]。IDH1/2 突变在急变期MPN 患者中聚集，在慢性期MPN 中少见[7]。在急变期MPN 中，IDH 突变预示着不良的预后及较低的存活率[24]。McKenney AS 等[38]研究发现，JAK2V617F 和突变体IDH1/2 的联合表达可以诱导MPN 进展，改变干/祖细胞功能，损害小鼠的分化，并导致具有白血病前期特征的MPN 表型加速，此类疾病的特点是红细胞增多症和白细胞增多症，突变的IDH1/2 与JAK2V617F 协同表达会导致原始细胞扩张和造血分化受损，最终引起疾病进展和不良结局，该研究还发现JAK2 和IDH1/2 同时突变的患者无白血病生存期较短。

3.2 RNA 剪接相关基因 RNA 剪接相关基因主要包括SRSF2、SF3B1、U2AF1、ZRSR2，突变通常与贫血和血小板减少症相关[6]。SRSF2 突变的特征之一是髓样偏向和向急性白血病转化的风险增加[39]。Smeets MF 等[39]的研究提示，SRSF2 突变在HSC 内的生理性表达导致了小鼠MPN 的发生，且SRSF2 突变必须在HSC 中表达才能启动MPN。SF3B1 基因与mRNA 剪接相关，其突变在许多情况下可导致RNA衰退[40]。SF3B1 体细胞突变预后良好[24]，携带SF3B1突变的患者染色体异常比例较低，血小板计数也较低[41]。剪接因子U2AF1 有两个突变热点区域（S34 和Q157），除极少数共同的靶点外，表达S34 和Q157突变的血液细胞存在不同的表达和剪接模式[42]。S34突变可能影响数百个mRNA 的翻译[42]，而Q157 突变是否影响mRNA 翻译目前尚不清楚。携带U2AF1突变的PV 和ET 患者与野生型患者相比，无骨髓纤维化生存率较低。大约35%的U2AF1 突变影响S34，65%的影响Q157 或其附近，只有Q157（及其附近） 突变与MPN 的总生存期显著缩短有关[43]。ZRSR2 位于X 染色体上，突变主要发生在男性患者中，ZRSR2 与U2AF2 剪接因子形成异源二聚体，参与识别次要内含子（U12 型）中的3'剪接位点，类似于主要（U2 型）剪接体中的U2AF1，ZRSR2 突变可导致U12 型内含子的剪接异常，致前体mRNA 剪接异常，从而产生异常的mRNA[44]。

3.3 转录因子基因 转录因子基因主要包括TP53、CUX1、IKZF1、RUNX1、NFE2，其中 TP53、CUX1、IKZF1 均为抑癌基因。TP53 在慢性期MPN 期间维持基因组稳定性方面发挥了关键作用[45]，其突变通过增加HSC 的自我更新和对细胞应激的抵抗力来促进AML 转化[45]。TP53 突变在慢性期MPN 中不常见，但在MPN 后AML 患者中存在[7]。TP53 突变通常与染色体17p 的畸变和5q 的缺失并存，突变通常发生在疾病的后期，患者预后差，转化为AML 的风险较高，早期死亡风险更高[46]。CUX1 缺失可加速MPN的白血病转化[47，48]，CUX1 损伤导致的DNA 修复功能障碍在MPN 的发病机制中起着重要作用，且功能丧失突变比错义突变会产生更严重的功能缺陷[49]。An N 等[50]发现，CUX1 基因敲除的小鼠发生了MDS 伴贫血和三系发育不良，最终导致HSC 衰竭。该研究指出，CUX1 是维持HSC 稳态的关键调节因子，可维持HSC 的静止状态，并抑制HSC 的增殖，单个7q基因CUX1 的减少足以引起髓系疾病。IKZF1 的缺失与MPN 向AML 的转化有关，其在慢性期MPN 中很少见，但在急变期MPN 患者中可检测到，约占17%[26]。IKZF1 突变可能导致JAK-STAT 通路的激活，因此其与MPN 的发生发展相关[51]。RUNX1 失活突变主要通过减少髓系分化和增加HSC 自我更新促进AML 的发展，其突变与较短的总生存率相关[31]。约4%～13%的MPN 后AML 患者存在RUNX1 突变，与野生型相比，此类患者的生存期显著缩短[31，35]。NFE2突变易导致转基因小鼠发生白血病转化[52]。JAK2V617F/NFE2 共同突变小鼠的血红蛋白和白细胞计数比JAK2V617F 突变小鼠高，表明突变体NFE2 促进了骨髓生成，并增强了JAK2V617F 诱导的MPN 表型[52]。

3.4 细胞信号转导相关基因 此类基因主要包括NRAS、KRAS、NF1、CBL、PTPN11、PPM1D。RAS 信号通路突变（NRAS/KRAS 突变）在MPN 中与白血病转化有关，而NRAS 突变更频繁，MPN 后AML 患者中存在7%～15%的NRAS/KRAS 突变[53]。You X 等[54]研究表明，KRAS 突变通过鸟嘌呤核苷酸交换因子Sos1 的介导驱动侵袭性MPN 表型，以Sos1 和致癌KRAS 相互作用为靶点的治疗可以提高KRAS 突变MPN 患者的存活率。与JAK-STAT 信号通路的突变相比，RAS 信号通路的突变与较短的总生存期和预后不良相关[43]。NF1 是RAS 信号的负调控因子，NF1的丧失在功能上等同于激活RAS 基因突变[6]。CBL突变在MPN 中很少见，通常与涉及RUNX1、FLT3、JAK2 和TP53 的突变共存[51]，其突变也与MPN 的低生存率显著相关[43]。PTPN11 属于原癌基因，其在MPN 中的突变与较短的总生存期相关[43]。PTPN11杂合错义突变在MPN 后AML 患者中占6%～8%，与患者生存期缩短有关[35]。PPM1D 也是一种原癌基因，其突变在健康人的血液及其它肿瘤患者中也被检测到，但在接受过化疗并被诊断出患有与治疗相关的髓系肿瘤的患者中更为常见[46,55]。截短PPM1D突变会产生化疗耐药表型，导致PPM1D 突变的造血细胞在体内外化疗时选择性扩增。在化疗的情况下，PPM1D 突变细胞的DNA 损伤反应被取消，导致细胞周期进程改变，凋亡减少，线粒体启动减少[55]。

4 突变数量及顺序与预后相关

不仅不同的突变与预后相关，有害突变的数量本身也代表了一个额外的不利预后因素。研究发现，2 个或更多的突变与缩短的无白血病生存期相关，且突变数量越多预后越差[32]。同时，突变的顺序也会影响临床表型。如Ortmann CA 等[56]研究显示，在同时含有TET2 或DNMT3A 突变的JAK2 突变MPN中，首先获得JAK2 突变的患者更有可能出现PV，并增加血栓形成的风险；相反，TET2 优先或DNMT3A 优先的患者更有可能患有ET。另外，获得体细胞突变的顺序还会影响治疗反应、干细胞和祖细胞的生物学以及MPN 患者的克隆进化等[15]。

5 总结

JAK2、CALR、MPL 突变激活JAK-STAT 信号是MPN 发病的核心，虽然目前暂未明确JAK2、MPL、CALR 和其他突变在MPN 发病中的具体意义，以及在决定疾病表型和干细胞受累程度中的相对作用。但目前认为，无论MPN 患者诊断或JAK2 突变状态如何，其特征都为独特的基因表达标签，即JAKSTAT 靶基因表达增加，表明这一通路在MPN 的发病机制中具有重要的作用。驱动基因突变伴随其它体细胞突变很常见，通常与疾病进展有关。MPN 的非特异性突变涉及广泛的细胞通路，而由于大多数突变造成相关功能丧失，故大多数非特异性突变基因是髓系肿瘤的抑制基因。目前MPN 的大多数非特异性突变基因的预后信息不足，且对多个突变如何协同导致预后不良及其有害突变如何具体影响蛋白质的功能，以及是否还有新的不良预后突变等都有待进一步发现。