三阴性乳腺癌与癌旁组织中差异表达环状RNA筛选及生物信息学分析

戴嘉婧 韩馨乐 钟福波 林哲广 江淑琪 韦伟 方征宇

乳腺癌是女性患病率最高的恶性肿瘤，也是女性患癌死亡的主要原因[1-2]，其分子亚型之一的三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)因免疫组化特征缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及表皮生长因子受体2(HER2)而缺少靶向治疗[3]。有临床研究发现，不同年龄段TNBC术后病人的临床病理特征相近，而年龄越小，预后越差[4]。目前寻找可靠的生物标记物来识别TNBC是药物研发领域的首要难点。近年来很多非编码RNA标记物,如miRNA、lncRNA、circRNA都随着测序技术得以发现。本研究利用生物信息学方法对从北京大学深圳医院甲状腺与乳腺外科收集到的1例TNBC病人手术样本测序结果的circRNA表达谱进行分析，筛选TNBC癌组织与癌旁组织中差异表达的circRNA，并预测circRNA下游可能的miRNA及靶基因，为寻找circRNA在TNBC中的调控途径及分子靶点的探究提供参考。

资料与方法

一、 数据来源

收集到1例在北京大学深圳医院甲状腺与乳腺外科接受手术治疗的TNBC病人手术样本，分析TNBC与癌旁组织转录组测序结果差异表达的circRNA。

二、方法

1. TNBC与癌旁组织差异表达circRNA的筛选 ：设定筛选条件为癌组织相对癌旁组织表达量变化≥5倍且P<0.05，得到差异表达的circRNA。

2.差异表达circRNA可能结合的miRNA及靶基因预测：分别选取在差异基因中表达上调或表达下调最显著的circRNA即 |logFC| 排在前5共10个circRNA。通过RegRNA2.0 网站(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)预测这10个circRNA可能结合的miRNA。再通过三个生物信息学网站miRDB(http://mirdb.org/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/mamm_31/)及RNAInter(http://www.rna-society.org/raid/search.html)预测每个miRNA的靶基因(mRNA)[5-8]。设定筛选条件为三个网站预测得分大于80分的靶基因。

3.下游靶基因的功能分析:通过在线生物信息注释数据库DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)[9]，对所得靶基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEEG)分析。P<0.05为差异有统计学意义。

4. 靶基因蛋白相互作用(PPI)网络分析及TNBC关键基因筛选:应用STRING在线工具分析预测出的靶基因PPI网络，将数据输出并导入Cytoscape软件，通过MCODE插件筛选关键基因。MCODE的标准设置：度值截止=2，节点得分截止值=0.2，K核心值=2。以MCODE≥2者作为TNBC关键基因。

5.关键基因表达与病人预后的关系分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线数据库(https://kmplot.com/)[10]，在breast cancer里选取包含255例TNBC病人的数据库。输入关键基因，分析关键基因表达水平与TNBC病人的预后关系。

结果

1. TNBC组织与正常组织中差异基因表达的circRNA见表1。 共筛选出6 547个差异表达的circRNA，其中在TNBC中表达上调2 311个、表达下调4 326个。选取其中变化最显著的10个circRNA进行后续分析。

2.差异表达circRNA结合的miRNA及靶基因：通过RegRNA 2.0 网站预测上述显著差异表达的circRNA结合的miRNA共12个，其中表达上调circRNA结合的miRNA共8个、表达下调circRNA可能结合的miRNA共4个。通过生物学信息网预测得到的得分≥ 80分的下游靶基因共1 161个。

3.靶基因GO分析及KEGG分析见表2。DAVID在线数据库分析上述1 161个靶基因，进行GO及KEGG分析。这些基因主要参与的生物学过程包括RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、染色质的共价修饰、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录、转录调控、DNA模板、神经系统的发育；相关分子功能包括蛋白结合、转录因子活性，序列特异性DNA结合、组蛋白乙酰转移酶活性调节、转录激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ启动子近端区域序列的特异性结合、beta-catenin结合；参与细胞成分包括细胞质、细胞核、电压门控钾离子通道复合物、核质、突触后致密区。靶基因信号通路主要富集在细胞内吞、缩宫素信号通路、Wnt信号通路及cGMP-PKG信号通路。

4.靶基因PPI网络分析及关键基因筛选结果：将上述1 161个靶基因输入STRING在线工具，再将所得数据导入Cytoscape软件，得到PPI网络，并通过MCODE插件筛选出5个关键基因 (UBOX5、UBE2G2、DTX3L、FZR1、RNF19A)。

5.关键基因表达与TNBC病人预后的关系：将关键基因UBOX5、UBE2G2、DTX3L、FZR1、RNF19A输入Kaplan-Meier Plotter在线数据库，发现UBE2G2与DTX3L低表达与TNBC病人总生存率不良有关。UBE2G2对应的上游miRNA和circRNA分别是hsa_miR-93-3p、hsa_circ_0001361；DTX3L对应的上游miRNA和circRNA分别是hsa_miR-2115-5p、hsa_circ_0002874。

讨论

circRNA是目前非编码RNA家族里最晚发现的一类RNA分子，其因特殊的首尾相连成闭合环状结构而得名。与其他小分子RNA相比，circRNA能耐受核酸外切酶的消化而具有更好的稳定性[11]。有研究发现，circRNA的异常表达与实体瘤的发生发展有密切关系[12]。在肿瘤的发生发展中，circRNA主要是通过影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移以及上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等过程来调控肿瘤细胞的生物学行为[13]。有研究报道，circANKS1B通过海绵作用结合miR-148a和miR-152-3p从而增加转录因子USF1的表达并上调TGF-1的表达，从而激活TGF-1/Smad信号通路来促进EMT在TNBC的发生[14]。

本研究通过分析1例TNBC与癌旁组织的circRNA测序数据，得到表达差异最为明显的10个circRNA。其中，有研究报道，hsa_circ_0000907可以通过circMYO9B/miR-4316/FOXP4轴促进乳腺癌细胞的增殖，侵袭及迁移等，且已被实验证实与正常乳腺上皮细胞相比，hsa_circ_0000907在乳腺癌细胞中表达水平增高[15]。此外，有研究证实，hsa_circ_0001361在膀胱癌中高表达，且通过circFNDC3B/miR-491-5p/MMP9轴促进膀胱癌细胞的侵袭和迁移[16]；同样在神经母细胞瘤中，有学者发现hsa_circ_0001361可能与下游靶基因NOTCH2、SERPINH1、及LAMC1有结合作用，进而促进神经母细胞瘤EMT的发生[17]；hsa_circ_0001361还有可能与肝癌的发生发展相关，一项以纳入5例肝细胞癌病人的癌组织测序研究发现，其亲本基因FNDC3B可能为hsa_circ_0001361促进肝癌细胞发生发展的靶基因[18]。而hsa_circ_0001361在TNBC中并无相关实验研究。

接下来本研究通过RegRNA 2.0网站分别预测出10个circRNA潜在调控的miRNA，进一步通过生物信息学网联合预测miRNA下游的mRNA并对预测到1161个mRNA进行GO分析、KEGG分析和PPI网络分析，得到了这些mRNA的功能、通路富集情况以及5个关键基因(UBOX5、UBE2G2、DTX3L、FZR1、RNF19A)。有学者发现，DTX3L通过DTX3L-LIPG-ISG15信号通路促进基底样TNBC细胞的转移[19]；此外，全反式维甲酸在乳腺癌细胞中刺激抗原呈递反应或调控免疫检查点抑制剂等过程是通过调控下游DTX3L的表达而发挥调节作用[20]。通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库分析关键基因，结果显示，UBE2G2和DTX3L的低表达与TNBC病人的总生存率低下有关。

本研究得出差异表达的circRNA可能通过circRNA/miRNA/mRNA调控模式影响TNBC细胞发生发展，hsa_circ_0001361/hsa_miR-93-3p/ UBE2G2轴和hsa_circ_0002874/hsa_miR-2115-5p/DTX3L轴可能在TNBC中发挥作用，其作用和功能有待深入的实验去证实。circRNA较其他小分子RNA不易被核酸外切酶消化的生物学特性使得血液或者唾液中分泌的circRNA作为生物学标志物被检测，对诊断疾病包括TNBC在内具有重要意义[21]。

总之，本研究通过生物信息学方法对TNBC与癌旁组织中差异表达的circRNA的进行分析，预测circRNA下游的miRNA及mRNA，得到TNBC中两条可能的调控途径，为TNBC的诊断和治疗探索新的靶点。