蛋白激酶C在疼痛及镇痛药物作用中的研究进展*

易小清，崔小娇，陈祝君，尹琪楠，苟梦秋，边原

(四川省医学科学院·四川省人民医院/电子科技大学附属医院药学部·个体化药物治疗四川省重点实验室，成都 610072)

疼痛发病机制复杂，按病理生理学机制主要分为伤害感受性疼痛、神经病理性疼痛两种类型；按发病持续时间分为急性疼痛和慢性疼痛。疼痛临床表现多样，全球范围内经受不同程度疼痛折磨的人数高达15亿人以上，而疼痛治疗效果的影响因素众多。对于很多顽固性疼痛会反复发作，极难治愈，是十分棘手的临床问题，使用镇痛药物后疼痛缓解程度不一。疼痛控制不佳会给患者造成极大的身心痛苦，导致患者身体衰弱和生活质量下降。

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的总称，由相对分子质量为77～83 ku的多肽单链构成。目前为止已经至少鉴定出10种PKC亚型，分为 A、B、C 3 组，A组称为典型或传统的PKC(conventional PKC，cPKCs)，包括 α、βI、βⅡ和γ亚类。B 组为新型PKC(novel PKC，nPKCs)，包括 δ、ε、η(L)和θ亚 类，C组为非典型 PKC(atypical PKC，aPKCs)，由ζ和λ亚类组成。其各种亚型参与细胞周期、细胞凋亡、有丝分裂、炎症反应等多种细胞内病理生理功能调控。PKC作为一种胞内第二信使，在神经元兴奋性的调制、信号传导、神经递质的释放、突触可塑性等中起到相关作用，同时有研究发现，PKC在疼痛传导中起重要作用。PKC家族在疼痛调节中具有同工酶特异性作用[1]。

临床常用的镇痛药物包括非甾体抗炎药、阿片类药物、抗惊厥类药物等。针对不同的疼痛类型及疼痛程度，选择的镇痛药物有所不同。对于神经病理性疼痛，钙离子通道调节剂加巴喷丁、普瑞巴林是一线推荐治疗药物。根据世界卫生组织(WHO)三阶梯镇痛治疗原则，轻度疼痛可选用非甾体类抗炎药物；中度疼痛可选用弱阿片类药物或低剂量的强阿片类药物，并可联合应用非甾体类抗炎药物以及辅助镇痛药物；重度疼痛首选强阿片类药，并可合用非甾体类抗炎药物以及辅助镇痛药物。通过规范、有效的治疗，患者疼痛可以得以缓解，但仍有部分患者的疼痛难以控制，仅通过常规的药物治疗效果不满意和(或)出现不能耐受的不良反应，成为医生、患者共同面临的棘手问题。有研究表明PKC与镇痛药物之间存在相互影响，因此PKC有望成为疼痛治疗的分子靶标。

1 PKC在不同疼痛中的研究

1.1镰状细胞病 镰状细胞病(sickle cell disease，SCD)又称镰状细胞性贫血症(sickle cell anemia)，这是一种遗传性疾病，患者的红细胞形状出现异常，呈镰刀状或者新月状，会导致血管内血液流动不畅，血氧传输受限，引起严重的疼痛和器官损伤。疼痛是SCD的最典型特征，患有SCD的患者在其一生中都经历着无法预测的反复发作的急性疼痛危机以及慢性持续疼痛[2]。疼痛可能始于婴儿期，并在整个生命中严重程度增加，从而导致住院和生活质量下降[3]。PKC各亚型PKCε、PKCα、PKCγ、PKCδ在SCD中均有研究报道，其中研究最多的是PKCδ[2]。在TOW小鼠中，通过分析PKCδ质-膜易位，在脊髓背角浅层中PKCδ的活化升高。脊髓PKCδ的过度活化仅在γ-氨基丁酸能神经元的抑制性神经元(GABAergic neuron，VGAT+)中发生，而在谷氨酸能兴奋性神经元(glutamatergic，VGLUT2+)中不发生。由于PKC激活可能会抑制GABA转运活性，因此PKCδ可能会通过抑制GABA的抑制性机制而促进SCD的慢性疼痛[4]。通过造血干细胞移植方法(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，建立了受体PKCδ-KO和WT小鼠典型的血液学缺陷和SCD的系统性体征，在缺乏PKCδ的小鼠中未检测到自发性疼痛或诱发性疼痛，这强烈表明，脊髓PKCδ是SCD中持续性和诱发性疼痛的产生和维持的关键机制[2]。

1.2椎间盘退变 椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)易导致退行性椎间盘突出症，如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症和椎间盘下腰痛等。大量的临床和基础研究表明，降钙素可以促进软骨细胞增殖，刺激Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，防止软骨退变。在建立大鼠尾椎间盘退变模型中，IL-1通过降低蛋白激酶C-ε磷酸化而增加PKC-δ磷酸化来诱导髓核细胞(nucleus pulposus cell，NPC)变化。降钙素治疗可以预防或逆转IL-1诱导的与变性相关的PKC信号传导的细胞变化，证实了降钙素对体内IVDD的积极作用。总而言之，这项研究首次阐明了降钙素在调节椎间盘核中基质成分中的重要作用，且降钙素可通过激活PKC-ε途径和抑制PKC-δ途径来延缓椎间盘核的变性[5]。

1.3慢性偏头痛 偏头痛是常见的慢性神经血管疾病，是一种突发性、多发性且具备着偏侧性、中重度的头痛病症。证据表明一氧化氮(NO)可能是偏头痛发病的一个致病因素，Western blotting实验显示，硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)和硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)NO供体给药后，硬脑膜内蛋白激酶Cγ和蛋白激酶Cε表达上调，磷酸化程度增加。此外，PKC阻滞剂可阻止NTG和SNP诱导的疼痛超敏反应。NTG可以增加蛋白激酶 Cα，γ，δ和ε 的磷酸化水平，而丙戊酸(Valproate，VP)抑制了PKC亚型的活性，证明VP是通过抑制NTG小鼠中的PKC信号传导来防止偏头痛造成的损害[6]。代谢型谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5)在中枢神经系统的突触可塑性中起着至关重要的作用，mGluR5可通过PKC/NR2B信号调节偏头痛中的突触可塑性来促进中枢敏化[7]。也有研究显示PKCγ诱导的谷氨酸受体(Glutamate receptor，GluR1)磷酸化可能参与偏头痛大鼠模型的中枢敏化[8]。

1.4炎症性疼痛 炎症时，感受器(C纤维)可逐渐被激活，表现出对机械性刺激敏感，致使炎症部位更易产生痛感。通过在大鼠关节内注射完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)构建慢性膝关节炎症模型，发现PKCα的信使核糖核酸和蛋白质表达平行增加，而背根神经节神经元中蛋白激酶C可能是通过上调了电压门控钠通道NaV1.9的表达，从而导致疼痛超敏[9]。瞬时受体电位香草酸1型(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)是一种处理热和化学敏感伤害信息的主要受体，在外周背根神经节神经元中TRPV1-PKCα和PKCε表达不同，得出的结论是PKCs通过增强TRPV1的活性引起炎症疼痛[10]。向大鼠的后爪连续反复注射前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)14 d构建慢性炎症性模型，抑制PKCε可减少持续性炎性伤害性感觉，其机制可能与抑制NF-κB p65亚基易位有关[11]。炎症性面部机械性痛觉异常的发展需要激活MDH-PKCγ和5-HT2AR，并与IIi层的形态和功能变化有关。在功能上，PKCγ+和PKCγ-中间神经元均显示静息膜电位(resting membrane potential，RMP)去极化和Rm降低；形态学上，只有PKCγ+中间神经元的树突复杂性降低，脊柱密度增加，依赖于5-HT2AR的激活。直接激活MDH-5-HT2AR可引起与周围CFA相同的面部机械性超敏反应和PKCγ+中间神经元形态学改变。这表明，一旦PKCγ+中间神经元经历了5-HT2AR依赖的结构动力学，低阈值机械输入可以进入浅表MDH/SDH的痛觉传导通路，触发机械性痛觉超敏[12]。

1.5癌性骨痛 癌性骨痛是所有癌性疼痛中最常见的症状，是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌及甲状腺癌等骨转移引起的骨破坏性骨痛，严重影响患者的生存质量并造成沉重的心理负担。在采用胫骨骨髓腔内注射3 μL MRMT-1大鼠乳腺癌细胞建立骨癌痛模型，与假骨癌痛组比较，骨癌痛组蓝斑核PKCα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，但骨癌痛组大鼠p-PKCα蛋白表达显著增加(P<0.01)[13]。有研究将Walker 256细胞接种至胫骨中可诱导出明显的机械性疼痛超敏反应，从接种后第6天到第15天，脊髓趋化因子CC亚族受体5(Spinal chemokine CC receptor 5，CCR5)和p-PKCγ表达上调，推测RANTES-CCR5-PKCγ通路可能通过脊髓内神经元-小胶质细胞的相互作用参与癌性骨痛(cancer-induced bone pain，CIBP)的维持[14]。PENG等[15]在癌性骨痛模型中，PKC磷酸化增加，首次发现PKC/ERK信号通路在调节癌性骨痛中的功能，通过抑制PKC/ERK信号通路，可增加缩爪阈值，减轻癌性骨痛。研究显示鞘内注射PKC抑制剂后，脊髓神经元PKC激活和高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)释放以及癌性骨痛大鼠机械性痛觉超敏均减弱，最终发现表明骨癌相关的痛觉过敏是由PKC诱导的HMGB1磷酸化驱动的，这导致HMGB1从细胞核移位，从背角的细胞质中释放出来，并激活脊髓促炎递质[16]。

1.6神经病理性疼痛 神经病理性疼痛是感觉神经系统病变引起的一种慢性疾病，常在神经和脊髓损伤或疾病后出现，临床常见的有糖尿病神经病理性疼痛、带状疱疹及带状疱疹后神经病理性疼痛、癌性神经病理性疼痛等。PKC作为胞内的第二信使，广泛分布于外周和中枢神经系统，是外周和中枢敏化的主要调节因子。瞬时受体电位褪黑素8(transient receptor potential melastatin 8，TRPM8)通道在痛觉传导的敏化过程中起着重要作用，被认为是治疗神经病理性疼痛的潜在靶点之一，在背根神经节中TRPM8通道参与了神经病理性疼痛大鼠冷、热痛觉过敏(非机械性痛觉超敏)的发生，其机制可能受PKC的调控[17]。鞘内注射PKC或PKA抑制剂可增强TREK-1活化剂在神经病变大鼠中观察到的抗痛觉超敏作用。相反，用PKC或PKA激活剂预处理可降低TREK-1活化剂诱导的抗痛觉超敏反应。数据表明，体内PKC/PKA可以动态调节TREK-1通道的活性，从而引起痛觉超敏，调节其在神经病理性疼痛中的抗痛觉超敏作用[18]。神经病理性疼痛的发生发展，其机制还可能与PKC促进某些炎症因子、离子通道、氨基酸受体、P2X受体、sigma-1受体等的表达或激活有关。

2 PKC与药物的作用

2.1阿片类药物 吗啡的镇痛效果强，是癌性中、重度疼痛治疗的首选药物之一，同时也可用于其他镇痛治疗无效的急性锐痛。长期使用吗啡类阿片药物易形成吗啡耐受，其表现为吗啡镇痛效应减弱，需加大用药剂量才能达到相同的效果。在阿片耐受产生的过程中PKC主要通过其含量或活性的变化参与信息的传递。长期应用阿片类药物致使脊髓背角浅层(Ⅰ或Ⅱ层)PKC的蛋白表达增加、PKC活性升高。而应用PKC抑制剂却能抑制PKC活性的增强，阻止或翻转吗啡耐受的形成和发展。PKC亚型较多，其中PKCα、γ和ε亚型参与了吗啡耐受。研究提示，MRgC的慢性激活通过PKC信号通路上调伤害性递质的表达，从而降低吗啡的镇痛效果[19]。长期吗啡暴露可显著增加背根节P2X3R、PKCε磷酸化的表达，而抑制PKCε信号通路可减轻吗啡诱导的耐受性[20]。

瑞芬太尼为芬太尼类μ型阿片受体激动剂，起效快，维持时间短，与其他芬太尼类似物明显不同。静脉内输注瑞芬太尼可以诱导成年大鼠机械和热痛觉过敏，而PKC抑制剂可以抑制这种痛觉过敏，同时也证实了PKC/CaMKII/ERK对瑞芬太尼刺激后体外胚胎DH神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)磷酸化和NMDA功能的影响[21]。PKC活性的升高是阿片受体脱敏及耐受形成的重要原因，而PKC抑制剂可明显消除或减轻阿片耐受的产生。因此选择性的抑制或阻断PKC上、下游的传导通路或PKC本身都是减轻或消除阿片耐受的重要手段，有望成为治疗阿片耐受的一个新途径。

2.2非甾体抗炎药物 非甾体抗炎药(non steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一类具有解热、镇痛、抗炎的药物，广泛用于疼痛治疗，如癌痛的第一阶梯治疗及癌性中、重度疼痛的辅助治疗，风湿类疼痛的治疗以及骨科疼痛治疗等。对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是通过抑制中枢神经系统中前列腺素的合成达到镇痛作用，无抗炎作用，临床主要用于普通感冒或流行性感冒引起的发热，以及缓解轻、中度疼痛，但其有肝毒性，可导致致命性或非致命性肝坏死。APAP处理后可导致PKCa移位到线粒体，并使线粒体PKC底物磷酸化，并且敲除PKCa对APAP诱导的肝损伤也有保护作用。研究显示可通过增强PKC途径的核因子红细胞2相关因子2(nuclear erythroid related factor-2，Nrf-2)来预防APAP引起的肝损伤[22]。

根据对COX-l和COX-2抑制强度的不同，NSAIDs可以分为非选择性NSAIDs和选择性COX-2抑制剂。塞来昔布是第一个选择性COX-2抑制剂，其引起胃肠道不良反应概率明显降低。在小鼠皮肤炎症模型中，局部应用塞来昔布可以降低水肿、增生、前列腺素E2水平，其机制可能是塞来昔布通过抑制PKC同工酶(α，ε，γ)易位达到的[23]。帕瑞昔布为首个注射用选择性COX-2抑制剂，对9例稳定的肝硬化患者进行了肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)筛查，帕瑞昔布在HPS患者血清的刺激下显著抑制了人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs)的定向集体迁移。此外，HPS患者血清显著上调了PKC的磷酸化，并通过COX-2/PGE2信号通路促进了Rac的激活，结果表明，由COX-2诱导的PKC/Rac信号传导可在HPS患者的病理性肺血管生成过程中调节HPMVEC的集体方向性迁移[24]。

2.3抗惊厥药 加巴喷丁(gabapentin，GBP)、普瑞巴林都是钙离子通道调节剂，作用机制为调节电压门控钙通道α2-δ亚基，可减轻疼痛，用于癌性疼痛的辅助治疗，是神经病理性疼痛的一线推荐用药。有研究在大鼠结肠内注射福尔马林以产生结肠炎疼痛，结果表明，腹膜内注射GBP后，大鼠的内脏疼痛程度有所减轻，而通过鞘内注射PKC抑制剂也可以减轻疼痛，研究得出结论的是GBP对内脏炎症性疼痛的镇痛作用是通过抑制PKC信号通路来介导的[25]。在部分切断眶下神经的小鼠模型(partial transection of the infraorbital nerve，pT-ION)中，引起原发性(V2皮肤)和继发性(V3皮肤)痛觉过敏，Cavα2δ1拮抗剂加巴喷丁可逆转这种痛觉过敏，pT-ION诱导PKC表达增加，但被靶向Cavα2δ1的干扰RNA逆转，因此认为Cavα2δ1通过其下游的PKC-TRPA/GJ信号传导途径促进了继发性痛觉过敏的发展[26]。普瑞巴林与中枢神经系统中α2-δ有高度亲和力，利用双电极电压钳技术在非洲爪蟾卵母细胞中表达了主要的神经元谷氨酸转运蛋白3(neuronal glutamate transporter type 3，EAAT3)，普瑞巴林可以增加EAAT3的活性，而PKC抑制剂预处理卵母细胞可显着降低普瑞巴林增强的EAAT3活性[27]。

3 小结与展望

疼痛是临床上最常见的症状之一，如果疼痛长时间不能有效控制，持续进展会逐渐影响患者的睡眠、情绪及社会活动。不同疾病引起疼痛的作用通路不同，本文阐述了PKC不同亚型参与在各类型疼痛中，通过整合多种受体通道产生效应，增强兴奋性信号通路并减少抑制性信号通路，从而引起疼痛。同时也阐述了PKC与阿片类药物、非甾体类抗炎药物、抗惊厥药等镇痛药物之间的相互作用、相互影响。

随着科学的不断发展，分子生物学技术已经应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测，肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究也提高到了基因分子水平。引起疼痛的原因多样，机制复杂，目前尚未完全明晰其具体机制，PKC在疼痛中的研究在逐渐增多，需进一步的研究和探讨，明确PKC在疼痛中的作用机制，以期成为治疗疼痛一个重要靶点。临床实践中疼痛治疗药物种类有限，PKC与常用镇痛药物之间存在相互作用、相互影响，并且多项研究已经证实PKC抑制剂可减轻吗啡诱导的耐受性，通过进一步的研究和探讨以期开发出镇痛效果好、不良反应更小的镇痛药物。